व्यापक प्रोटिओमिक्स स्पर्शोन्मुख और रोगसूचक अल्जाइमर रोग में मस्तिष्क-आधारित मस्तिष्कमेरु द्रव बायोमार्कर का खुलासा करता है

अल्जाइमर रोग (एडी) में प्रोटीन बायोमार्कर की कमी होती है जो इसके कई अंतर्निहित पैथोफिजियोलॉजी को दर्शाता है, जो निदान और उपचार की प्रगति में बाधा डालता है। यहां, हम मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) बायोमार्कर की पहचान करने के लिए व्यापक प्रोटिओमिक्स का उपयोग करते हैं जो एडी पैथोफिजियोलॉजी की एक विस्तृत श्रृंखला का प्रतिनिधित्व करते हैं। मल्टीप्लेक्स मास स्पेक्ट्रोमेट्री ने एडी सीएसएफ और मस्तिष्क में क्रमशः लगभग 3,500 और लगभग 12,000 प्रोटीन की पहचान की। मस्तिष्क प्रोटीओम के नेटवर्क विश्लेषण ने 44 जैव विविधता मॉड्यूल का समाधान किया, जिनमें से 15 मस्तिष्कमेरु द्रव प्रोटीओम के साथ ओवरलैप हुए। इन ओवरलैपिंग मॉड्यूल में सीएसएफ एडी मार्कर पांच प्रोटीन समूहों में तब्दील हो जाते हैं, जो विभिन्न पैथोफिजियोलॉजिकल प्रक्रियाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं। एडी मस्तिष्क में सिनैप्स और मेटाबोलाइट्स कम हो जाते हैं, लेकिन सीएसएफ बढ़ जाता है, जबकि मस्तिष्क और सीएसएफ में ग्लियाल-समृद्ध माइलिनेशन और प्रतिरक्षा समूह बढ़ जाते हैं। 500 से अधिक अतिरिक्त सीएसएफ नमूनों में पैनल परिवर्तनों की स्थिरता और रोग विशिष्टता की पुष्टि की गई। इन समूहों ने स्पर्शोन्मुख AD में जैविक उपसमूहों की भी पहचान की। कुल मिलाकर, ये परिणाम एडी में नैदानिक ​​​​अनुप्रयोगों के लिए वेब-आधारित बायोमार्कर टूल की दिशा में एक आशाजनक कदम हैं।
अल्जाइमर रोग (एडी) दुनिया भर में न्यूरोडीजेनेरेटिव डिमेंशिया का सबसे आम कारण है और यह सिनैप्टिक ट्रांसमिशन, ग्लियाल-मध्यस्थता प्रतिरक्षा और माइटोकॉन्ड्रियल चयापचय (1-3) सहित जैविक प्रणाली की शिथिलता की एक विस्तृत श्रृंखला की विशेषता है। हालाँकि, इसके स्थापित प्रोटीन बायोमार्कर अभी भी अमाइलॉइड और ताऊ प्रोटीन का पता लगाने पर ध्यान केंद्रित करते हैं, और इसलिए इस विविध पैथोफिज़ियोलॉजी को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं। ये "कोर" प्रोटीन बायोमार्कर जिन्हें मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ) में सबसे विश्वसनीय रूप से मापा जाता है, उनमें शामिल हैं (i) अमाइलॉइड बीटा पेप्टाइड 1-42 (Aβ1-42), जो कॉर्टिकल अमाइलॉइड प्लाक के गठन को दर्शाता है; (ii) कुल ताऊ, अक्षतंतु अध:पतन का संकेत; (iii) फॉस्फो-ताउ (पी-ताउ), पैथोलॉजिकल ताऊ हाइपरफॉस्फोराइलेशन (4-7) का प्रतिनिधि। यद्यपि इन मस्तिष्कमेरु द्रव बायोमार्करों ने "चिह्नित" एडी प्रोटीन रोगों (4-7) का पता लगाने में हमारी बहुत मदद की है, वे रोग के पीछे जटिल जीव विज्ञान के केवल एक छोटे से हिस्से का प्रतिनिधित्व करते हैं।
एडी बायोमार्कर की पैथोफिजियोलॉजिकल विविधता की कमी ने कई चुनौतियों को जन्म दिया है, जिनमें (i) एडी रोगियों की जैविक विविधता की पहचान करने और मात्रा निर्धारित करने में असमर्थता, (ii) रोग की गंभीरता और प्रगति की अपर्याप्त माप, विशेष रूप से प्रीक्लिनिकल चरण में, और ( iii) चिकित्सीय दवाओं का विकास जो न्यूरोलॉजिकल गिरावट के सभी पहलुओं को पूरी तरह से हल करने में विफल रहा। संबंधित बीमारियों से एडी का वर्णन करने के लिए ऐतिहासिक विकृति विज्ञान पर हमारी निर्भरता केवल इन समस्याओं को बढ़ाती है। अधिक से अधिक साक्ष्य दर्शाते हैं कि मनोभ्रंश से पीड़ित अधिकांश बुजुर्ग लोगों में संज्ञानात्मक गिरावट की एक से अधिक रोग संबंधी विशेषताएं होती हैं (8)। एडी विकृति विज्ञान वाले 90% या अधिक व्यक्तियों में संवहनी रोग, टीडीपी-43 समावेशन, या अन्य अपक्षयी रोग (9) भी हैं। पैथोलॉजिकल ओवरलैप के इन उच्च अनुपात ने मनोभ्रंश के लिए हमारे वर्तमान नैदानिक ​​ढांचे को बाधित कर दिया है, और रोग की अधिक व्यापक पैथोफिजियोलॉजिकल परिभाषा की आवश्यकता है।
विभिन्न प्रकार के एडी बायोमार्कर की तत्काल आवश्यकता को देखते हुए, क्षेत्र बायोमार्कर की खोज के लिए समग्र प्रणाली पर आधारित "ओमिक्स" पद्धति को तेजी से अपना रहा है। एक्सेलेरेटेड फार्मास्युटिकल पार्टनरशिप (एएमपी)-एडी एलायंस 2014 में लॉन्च किया गया था और यह कार्यक्रम में सबसे आगे है। राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, शिक्षा और उद्योग द्वारा इस बहु-विषयक प्रयास का उद्देश्य एडी के पैथोफिजियोलॉजी को बेहतर ढंग से परिभाषित करने और जैव विविधता निदान विश्लेषण और उपचार रणनीतियों (10) को विकसित करने के लिए सिस्टम-आधारित रणनीतियों का उपयोग करना है। इस परियोजना के हिस्से के रूप में, नेटवर्क प्रोटिओमिक्स AD में सिस्टम-आधारित बायोमार्कर की उन्नति के लिए एक आशाजनक उपकरण बन गया है। यह निष्पक्ष डेटा-संचालित दृष्टिकोण जटिल प्रोटिओमिक्स डेटा सेट को सह-व्यक्त प्रोटीन के समूहों या "मॉड्यूल" में व्यवस्थित करता है जो विशिष्ट सेल प्रकार, ऑर्गेनेल और जैविक कार्यों (11-13) से जुड़े होते हैं। एडी मस्तिष्क (13-23) पर लगभग 12 सूचना-समृद्ध नेटवर्क प्रोटिओमिक्स अध्ययन आयोजित किए गए हैं। कुल मिलाकर, इन विश्लेषणों से संकेत मिलता है कि एडी मस्तिष्क नेटवर्क प्रोटिओम स्वतंत्र समूहों और एकाधिक कॉर्टिकल क्षेत्रों में एक अत्यधिक संरक्षित मॉड्यूलर संगठन बनाए रखता है। इसके अलावा, इनमें से कुछ मॉड्यूल डेटा सेटों में एडी-संबंधित प्रचुरता में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिवर्तन दिखाते हैं, जो कई बीमारियों के पैथोफिज़ियोलॉजी को दर्शाते हैं। सामूहिक रूप से, ये निष्कर्ष AD में सिस्टम-आधारित बायोमार्कर के रूप में मस्तिष्क नेटवर्क प्रोटिओम की खोज के लिए एक आशाजनक एंकर बिंदु प्रदर्शित करते हैं।
AD मस्तिष्क नेटवर्क प्रोटिओम को चिकित्सकीय रूप से उपयोगी सिस्टम-आधारित बायोमार्कर में बदलने के लिए, हमने मस्तिष्क-व्युत्पन्न नेटवर्क को AD CSF के प्रोटिओमिक विश्लेषण के साथ जोड़ा। इस एकीकृत दृष्टिकोण से सीएसएफ बायोमार्कर के पांच आशाजनक सेटों की पहचान हुई जो मस्तिष्क-आधारित पैथोफिज़ियोलॉजी की एक विस्तृत श्रृंखला से जुड़े हैं, जिनमें सिनैप्स, रक्त वाहिकाएं, माइलिनेशन, सूजन और चयापचय मार्गों की शिथिलता शामिल है। हमने कई प्रतिकृति विश्लेषणों के माध्यम से इन बायोमार्कर पैनलों को सफलतापूर्वक मान्य किया है, जिसमें विभिन्न न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों से 500 से अधिक सीएसएफ नमूने शामिल हैं। इन सत्यापन विश्लेषणों में स्पर्शोन्मुख AD (AsymAD) वाले रोगियों के CSF में समूह लक्ष्यों की जांच करना या सामान्य संज्ञानात्मक वातावरण में असामान्य अमाइलॉइड संचय के प्रमाण दिखाना शामिल है। ये विश्लेषण AsymAD आबादी में महत्वपूर्ण जैविक विविधता को उजागर करते हैं और पैनल मार्करों की पहचान करते हैं जो बीमारी के शुरुआती चरणों में व्यक्तियों को उपप्रकार देने में सक्षम हो सकते हैं। कुल मिलाकर, ये परिणाम कई प्रणालियों पर आधारित प्रोटीन बायोमार्कर टूल के विकास में एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करते हैं जो एडी के सामने आने वाली कई नैदानिक ​​चुनौतियों को सफलतापूर्वक हल कर सकते हैं।
इस अध्ययन का मुख्य उद्देश्य नए मस्तिष्कमेरु द्रव बायोमार्कर की पहचान करना है जो विभिन्न मस्तिष्क-आधारित पैथोफिजियोलॉजी को दर्शाते हैं जो एडी की ओर ले जाते हैं। चित्र S1 हमारी अनुसंधान पद्धति को रेखांकित करता है, जिसमें (i) मस्तिष्क से संबंधित कई CSF रोग बायोमार्कर की पहचान करने के लिए AD CSF और नेटवर्क ब्रेन प्रोटिओम के प्रारंभिक निष्कर्षों द्वारा संचालित एक व्यापक विश्लेषण, और (ii) बाद की प्रतिकृति शामिल है। ये बायोमार्कर कई स्वतंत्र सेरेब्रोस्पाइनल में हैं। द्रव समूह. खोज-उन्मुख अनुसंधान एमोरी गोइज़ुएटा अल्जाइमर रोग अनुसंधान केंद्र (एडीआरसी) में 20 संज्ञानात्मक रूप से सामान्य व्यक्तियों और 20 एडी रोगियों में सीएसएफ की विभेदक अभिव्यक्ति के विश्लेषण के साथ शुरू हुआ। AD के निदान को कम Aβ1-42 और मस्तिष्कमेरु द्रव में कुल ताऊ और पी-ताउ के ऊंचे स्तर की उपस्थिति में एक महत्वपूर्ण संज्ञानात्मक हानि के रूप में परिभाषित किया गया है [मीन मॉन्ट्रियल संज्ञानात्मक मूल्यांकन (MoCA), 13.8 ± 7.0] [एलिसा (एलिसा) )]] (तालिका एस1ए)। नियंत्रण (मतलब MoCA, 26.7 ± 2.2) में CSF बायोमार्कर का स्तर सामान्य था।
मानव सीएसएफ को प्रोटीन प्रचुरता की एक गतिशील श्रृंखला की विशेषता है, जिसमें एल्ब्यूमिन और अन्य अत्यंत प्रचुर प्रोटीन रुचि के प्रोटीन का पता लगाने से रोक सकते हैं (24)। प्रोटीन खोज की गहराई बढ़ाने के लिए, हमने मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) विश्लेषण (24) से पहले प्रत्येक सीएसएफ नमूने से पहले 14 अत्यधिक प्रचुर प्रोटीन को हटा दिया। एमएस द्वारा कुल 39,805 पेप्टाइड्स की पहचान की गई, जिन्हें 40 नमूनों में 3691 प्रोटिओम में मैप किया गया था। प्रोटीन की मात्रा का निर्धारण मल्टीपल टेंडेम मास टैग (टीएमटी) लेबलिंग (18, 25) द्वारा किया जाता है। लापता डेटा को हल करने के लिए, हमने केवल उन प्रोटीनों को शामिल किया जिन्हें बाद के विश्लेषण में कम से कम 50% नमूनों में मात्राबद्ध किया गया था, इस प्रकार अंततः 2875 प्रोटिओम की मात्रा निर्धारित की गई। कुल प्रोटीन बहुतायत स्तर में महत्वपूर्ण अंतर के कारण, एक नियंत्रण नमूने को सांख्यिकीय रूप से एक बाहरी (13) माना गया और बाद के विश्लेषण में शामिल नहीं किया गया। शेष 39 नमूनों के बहुतायत मूल्यों को उम्र, लिंग और बैच सहप्रसरण (13-15, 17, 18, 20, 26) के अनुसार समायोजित किया गया था।
प्रतिगमन डेटा सेट पर अंतर अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए सांख्यिकीय टी-परीक्षण विश्लेषण का उपयोग करते हुए, इस विश्लेषण ने उन प्रोटीनों की पहचान की जिनके बहुतायत स्तर नियंत्रण और एडी मामलों (तालिका एस 2 ए) के बीच महत्वपूर्ण रूप से बदल गए थे (पी <0.05)। जैसा कि चित्र 1ए में दिखाया गया है, AD में कुल 225 प्रोटीनों की प्रचुरता काफी कम हो गई थी, और 303 प्रोटीनों की प्रचुरता काफी बढ़ गई थी। इन विभेदित रूप से व्यक्त प्रोटीनों में पहले से पहचाने गए कई मस्तिष्कमेरु द्रव एडी मार्कर शामिल हैं, जैसे सूक्ष्मनलिका-संबंधित प्रोटीन ताऊ (एमएपीटी; पी = 3.52 × 10−8), न्यूरोफिलामेंट (एनईएफएल; पी = 6.56 × 10−3), विकास-संबंधित प्रोटीन 43 (जीएपी43; पी = 1.46 × 10−5), फैटी एसिड बाइंडिंग प्रोटीन 3 (एफएबीपी3; पी = 2.00 × 10−5), चिटिनेज 3 लाइक 1 (सीएचआई3एल1; पी = 4.44 × 10−6), न्यूरल ग्रैनुलिन (एनआरजीएन; पी = 3.43 × 10−4) और वीजीएफ तंत्रिका वृद्धि कारक (वीजीएफ; पी = 4.83 × 10−3) (4-6)। हालाँकि, हमने अन्य बहुत महत्वपूर्ण लक्ष्यों की भी पहचान की, जैसे जीडीपी पृथक्करण अवरोधक 1 (जीडीआई1; पी = 1.54 × 10-10) और एसपीएआरसी-संबंधित मॉड्यूलर कैल्शियम बाइंडिंग 1 (एसएमओसी1; पी = 6.93 × 10-9)। 225 महत्वपूर्ण रूप से कम किए गए प्रोटीनों के जीन ओन्टोलॉजी (जीओ) विश्लेषण से स्टेरॉयड चयापचय, रक्त जमावट और हार्मोन गतिविधि (चित्रा 1 बी और तालिका एस 2 बी) जैसी शरीर की तरल प्रक्रियाओं के साथ घनिष्ठ संबंध का पता चला। इसके विपरीत, 303 की उल्लेखनीय रूप से बढ़ी हुई प्रोटीन कोशिका संरचना और ऊर्जा चयापचय से निकटता से संबंधित है।
(ए) ज्वालामुखी प्लॉट टी-परीक्षण द्वारा प्राप्त -लॉग10 सांख्यिकीय पी मान (वाई-अक्ष) के सापेक्ष लॉग2 गुना परिवर्तन (एक्स-अक्ष) दिखाता है, जिसका उपयोग नियंत्रण (सीटी) और के बीच अंतर अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए किया जाता है। सभी प्रोटीनों में से सीएसएफ प्रोटिओम के एडी मामले। एडी में काफी कम स्तर (पी <0.05) वाले प्रोटीन को नीले रंग में दिखाया गया है, जबकि बीमारी में काफी बढ़े हुए स्तर वाले प्रोटीन को लाल रंग में दिखाया गया है। चयनित प्रोटीन को लेबल किया गया है। (बी) प्रोटीन से संबंधित शीर्ष जीओ शब्द एडी में काफी कम (नीला) और बढ़े हुए (लाल) हैं। जैविक प्रक्रियाओं, आणविक कार्यों और सेलुलर घटकों के क्षेत्र में उच्चतम z-स्कोर के साथ तीन GO शब्द दिखाता है। (सी) एमएस ने सीएसएफ नमूने (बाएं) में एमएपीटी स्तर और नमूना एलिसा ताऊ स्तर (दाएं) के साथ इसका सहसंबंध मापा। प्रासंगिक पी मान के साथ पियर्सन सहसंबंध गुणांक प्रदर्शित किया जाता है। एक एडी मामले के लिए एलिसा डेटा की कमी के कारण, इन आंकड़ों में 39 विश्लेषण किए गए मामलों में से 38 के मान शामिल हैं। (डी) नियंत्रण पर पर्यवेक्षित क्लस्टर विश्लेषण (पी <0.0001, बेन्जामिनी-होचबर्ग (बीएच) समायोजित पी <0.01) और एडी सीएसएफ ने डेटा सेट में 65 सबसे महत्वपूर्ण रूप से परिवर्तित प्रोटीन का उपयोग करके नमूने पाए। मानकीकृत करें, सामान्यीकृत करें।
एमएपीटी का प्रोटिओमिक स्तर स्वतंत्र रूप से मापे गए एलिसा ताऊ स्तर (आर = 0.78, पी = 7.8 × 10-9; चित्र 1सी) से निकटता से संबंधित है, जो हमारे एमएस माप की वैधता का समर्थन करता है। अमाइलॉइड अग्रदूत प्रोटीन (एपीपी) के स्तर पर ट्रिप्सिन पाचन के बाद, Aβ1-40 और Aβ1-42 के सी-टर्मिनस पर मैप किए गए आइसोफॉर्म-विशिष्ट पेप्टाइड्स को कुशलतापूर्वक आयनित नहीं किया जा सकता है (27, 28)। इसलिए, हमने जिन एपीपी पेप्टाइड्स की पहचान की है उनका ELISA Aβ1-42 स्तरों से कोई लेना-देना नहीं है। प्रत्येक मामले की विभेदक अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए, हमने नमूनों का पर्यवेक्षित क्लस्टर विश्लेषण (तालिका S2A) करने के लिए P <0.0001 [झूठी खोज दर (FDR) सही P <0.01] के साथ विभेदित रूप से व्यक्त प्रोटीन का उपयोग किया। जैसा कि चित्र 1डी में दिखाया गया है, नियंत्रण जैसी विशेषताओं वाले एक एडी मामले को छोड़कर, ये 65 अत्यधिक महत्वपूर्ण प्रोटीन रोग की स्थिति के अनुसार नमूनों को सही ढंग से क्लस्टर कर सकते हैं। इन 65 प्रोटीनों में से 63 AD में बढ़े, जबकि केवल दो (CD74 और ISLR) कम हुए। कुल मिलाकर, इन मस्तिष्कमेरु द्रव विश्लेषणों ने AD में सैकड़ों प्रोटीनों की पहचान की है जो रोग बायोमार्कर के रूप में काम कर सकते हैं।
फिर हमने AD मस्तिष्क प्रोटिओम का एक स्वतंत्र नेटवर्क विश्लेषण किया। इस खोज के मस्तिष्क समूह में नियंत्रण से डोर्सोलेटरल प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स (डीएलपीएफसी), पार्किंसंस रोग (पीडी; एन = 10), मिश्रित एडी/पीडी (एन = 10) और एडी (एन = 10) मामले शामिल थे। ) नमूना। एमरी गोइज़ुएटा एडीआरसी। इन 40 मामलों की जनसांख्यिकी को पहले वर्णित किया गया है (25) और तालिका एस1बी में संक्षेपित किया गया है। हमने इन 40 मस्तिष्क ऊतकों और 27 मामलों के प्रतिकृति समूह का विश्लेषण करने के लिए टीएमटी-एमएस का उपयोग किया। कुल मिलाकर, इन दो मस्तिष्क डेटा सेटों ने 227,121 अद्वितीय पेप्टाइड्स का उत्पादन किया, जिन्हें 12,943 प्रोटिओम (25) में मैप किया गया था। केवल वे प्रोटीन जिनकी मात्रा कम से कम 50% मामलों में निर्धारित की गई थी, उन्हें बाद की जांच में शामिल किया गया था। अंतिम खोज डेटा सेट में 8817 मात्राबद्ध प्रोटीन शामिल हैं। उम्र, लिंग और पोस्टमार्टम अंतराल (पीएमआई) के आधार पर प्रोटीन बहुतायत स्तर को समायोजित करें। प्रतिगमन के बाद सेट किए गए डेटा के विभेदक अभिव्यक्ति विश्लेषण से पता चला कि दो या दो से अधिक रोग समूहों में >2000 प्रोटीन स्तर में काफी बदलाव आया था [पी <0.05, विचरण का विश्लेषण (एनोवा)]। फिर, हमने विभेदित रूप से व्यक्त प्रोटीन और AD/नियंत्रण और/या AD/PD तुलनाओं में P <0.0001 (चित्र S2, A और B, तालिका S2C) के आधार पर एक पर्यवेक्षित क्लस्टर विश्लेषण किया। ये 165 अत्यधिक परिवर्तित प्रोटीन नियंत्रण और पीडी नमूनों से एडी विकृति वाले मामलों को स्पष्ट रूप से दर्शाते हैं, जो पूरे प्रोटिओम में मजबूत एडी-विशिष्ट परिवर्तनों की पुष्टि करते हैं।
फिर हमने खोजे गए मस्तिष्क प्रोटिओम पर नेटवर्क विश्लेषण करने के लिए वेटेड जीन को-एक्सप्रेशन नेटवर्क एनालिसिस (डब्ल्यूजीसीएनए) नामक एक एल्गोरिदम का उपयोग किया, जो समान अभिव्यक्ति पैटर्न (11-13) के साथ प्रोटीन मॉड्यूल में डेटा सेट को व्यवस्थित करता है। विश्लेषण में 44 मॉड्यूल (एम) सह-व्यक्त प्रोटीन की पहचान की गई, जिन्हें सबसे बड़े (एम1, एन = 1821 प्रोटीन) से लेकर सबसे छोटे (एम44, एन = 34 प्रोटीन) तक क्रमबद्ध और क्रमांकित किया गया (चित्र 2ए और तालिका एस2डी))। जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है (13) प्रत्येक मॉड्यूल की प्रतिनिधि अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल या विशेषता प्रोटीन की गणना करें, और इसे रोग स्थिति और एडी पैथोलॉजी के साथ सहसंबंधित करें, अर्थात, अल्जाइमर रोग रजिस्ट्री (सीईआरएडी) और ब्रैक स्कोर (चित्र 2बी) का गठबंधन स्थापित करें। कुल मिलाकर, 17 मॉड्यूल एडी न्यूरोपैथोलॉजी (पी <0.05) से महत्वपूर्ण रूप से संबंधित थे। इनमें से कई रोग-संबंधी मॉड्यूल कोशिका प्रकार-विशिष्ट मार्करों से भी समृद्ध हैं (चित्र 2बी)। जैसा कि ऊपर बताया गया है (13), सेल प्रकार संवर्धन मॉड्यूल ओवरलैप और सेल प्रकार-विशिष्ट जीन की संदर्भ सूची का विश्लेषण करके निर्धारित किया जाता है। ये जीन पृथक माउस न्यूरॉन्स, एंडोथेलियल और ग्लियाल कोशिकाओं में प्रकाशित डेटा से प्राप्त होते हैं। आरएनए अनुक्रमण (आरएनए-सीक्यू) प्रयोग (29)।
(ए) मस्तिष्क प्रोटिओम के डब्ल्यूजीसीएनए की खोज करें। (बी) एडी न्यूरोपैथोलॉजिकल विशेषताओं (शीर्ष) के साथ मॉड्यूलर सिग्नेचर प्रोटीन (मॉड्यूलर प्रोटीन अभिव्यक्ति का पहला प्रमुख घटक) का बायवेट मिडकोरिलेशन (बीकोर) विश्लेषण, जिसमें सीईआरएडी (एβ प्लाक) और ब्रैक (ताऊ टेंगल्स) स्कोर शामिल हैं। सकारात्मक (लाल) और नकारात्मक (नीला) सहसंबंधों की तीव्रता को दो-रंग के ताप मानचित्र द्वारा दिखाया गया है, और तारांकन सांख्यिकीय महत्व (पी <0.05) दर्शाते हैं। प्रत्येक प्रोटीन मॉड्यूल के सेल प्रकार एसोसिएशन का आकलन करने के लिए हाइपरजियोमेट्रिक फिशर सटीक टेस्ट (एफईटी) (नीचे) का उपयोग करें। लाल छायांकन की तीव्रता कोशिका प्रकार संवर्धन की डिग्री को इंगित करती है, और तारांकन सांख्यिकीय महत्व (पी <0.05) को इंगित करता है। FET से प्राप्त P मान को सही करने के लिए BH विधि का उपयोग करें। (सी) मॉड्यूलर प्रोटीन का विश्लेषण करें। प्रत्येक मॉड्यूल या संबंधित मॉड्यूल समूह के लिए सबसे निकट से संबंधित जैविक प्रक्रियाएं दिखाई जाती हैं। ऑलिगो, ऑलिगोडेंड्रोसाइट।
पांच निकट से संबंधित एस्ट्रोसाइट और माइक्रोग्लिया-समृद्ध मॉड्यूल (एम30, एम29, एम18, एम24, और एम5) के एक सेट ने एडी न्यूरोपैथोलॉजी (चित्रा 2बी) के साथ एक मजबूत सकारात्मक सहसंबंध दिखाया। ऑन्टोलॉजी विश्लेषण इन ग्लियाल मॉड्यूल को कोशिका वृद्धि, प्रसार और प्रतिरक्षा (चित्र 2C और तालिका S2E) से जोड़ता है। दो अतिरिक्त ग्लियाल मॉड्यूल, एम8 और एम22, भी बीमारी में दृढ़ता से अपग्रेड किए गए हैं। एम8 टोल-जैसे रिसेप्टर मार्ग से अत्यधिक संबंधित है, एक सिग्नलिंग कैस्केड जो जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया (30) में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। साथ ही, एम22 अनुवादोत्तर संशोधन से निकटता से संबंधित है। एम2, जो ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स में समृद्ध है, एडी पैथोलॉजी के साथ एक मजबूत सकारात्मक सहसंबंध और न्यूक्लियोसाइड संश्लेषण और डीएनए प्रतिकृति के साथ एक ऑन्टोलॉजिकल संबंध दिखाता है, जो रोगों में बढ़े हुए सेल प्रसार का संकेत देता है। कुल मिलाकर, ये निष्कर्ष ग्लियाल मॉड्यूल की उन्नति का समर्थन करते हैं जिन्हें हमने पहले एडी नेटवर्क प्रोटिओम (13, 17) में देखा है। वर्तमान में यह पाया गया है कि नेटवर्क में कई एडी-संबंधित ग्लियाल मॉड्यूल नियंत्रण और पीडी मामलों में कम अभिव्यक्ति स्तर दिखाते हैं, जो उनकी बीमारी विशिष्टता को उजागर करते हैं जो एडी (चित्रा एस 2 सी) में ऊंचा है।
हमारे नेटवर्क प्रोटिओम (एम1, एम3, एम10, और एम32) में केवल चार मॉड्यूल एडी पैथोलॉजी (पी <0.05) (चित्रा 2, बी और सी) के साथ दृढ़ता से नकारात्मक रूप से सहसंबद्ध हैं। एम1 और एम3 दोनों ही न्यूरोनल मार्करों से समृद्ध हैं। एम1 अत्यधिक सिनैप्टिक संकेतों से संबंधित है, जबकि एम3 माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन से निकटता से संबंधित है। एम10 और एम32 के लिए कोशिका प्रकार संवर्धन का कोई सबूत नहीं है। एम32 एम3 और कोशिका चयापचय के बीच संबंध को दर्शाता है, जबकि एम10 कोशिका वृद्धि और सूक्ष्मनलिकाय कार्य से अत्यधिक संबंधित है। AD की तुलना में, सभी चार मॉड्यूल नियंत्रण और PD में बढ़ जाते हैं, जिससे उन्हें रोग-विशिष्ट AD परिवर्तन मिलते हैं (चित्र S2C)। कुल मिलाकर, ये परिणाम न्यूरॉन-समृद्ध मॉड्यूल की कम हुई बहुतायत का समर्थन करते हैं जो हमने पहले AD (13, 17) में देखा था। संक्षेप में, हमने जो मस्तिष्क प्रोटिओम का नेटवर्क विश्लेषण खोजा, उसने हमारे पिछले निष्कर्षों के अनुरूप AD-विशेष रूप से परिवर्तित मॉड्यूल का उत्पादन किया।
AD को प्रारंभिक स्पर्शोन्मुख चरण (AsymAD) की विशेषता है, जिसमें व्यक्ति नैदानिक ​​​​संज्ञानात्मक गिरावट के बिना अमाइलॉइड संचय प्रदर्शित करते हैं (5, 31)। यह स्पर्शोन्मुख चरण शीघ्र पता लगाने और हस्तक्षेप के लिए एक महत्वपूर्ण खिड़की का प्रतिनिधित्व करता है। हमने पहले स्वतंत्र डेटा सेटों (13, 17) में AsymAD और AD मस्तिष्क नेटवर्क प्रोटिओम के मजबूत मॉड्यूलर संरक्षण का प्रदर्शन किया है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि वर्तमान में हमने जो मस्तिष्क नेटवर्क खोजा है वह इन पिछले निष्कर्षों के अनुरूप है, हमने 27 डीएलपीएफसी संगठनों से प्रतिकृति डेटा सेट में 44 मॉड्यूल के संरक्षण का विश्लेषण किया। इन संगठनों में नियंत्रण (n = 10), AsymAD (n = 8) और AD (n = 9) मामले शामिल हैं। नियंत्रण और AD नमूने हमारी खोज मस्तिष्क समूह (तालिका S1B) के विश्लेषण में शामिल किए गए थे, जबकि AsymAD मामले केवल प्रतिकृति समूह में अद्वितीय थे। ये AsymAD मामले भी एमोरी गोइज़ुएटा ADRC ब्रेन बैंक से आए थे। यद्यपि मृत्यु के समय अनुभूति सामान्य थी, अमाइलॉइड का स्तर असामान्य रूप से उच्च था (मतलब सीईआरएडी, 2.8 ± 0.5) (तालिका एस1बी)।
इन 27 मस्तिष्क ऊतकों के टीएमटी-एमएस विश्लेषण के परिणामस्वरूप 11,244 प्रोटिओम की मात्रा निर्धारित हुई। इस अंतिम गणना में केवल वे प्रोटीन शामिल हैं जो कम से कम 50% नमूनों में मात्राबद्ध हैं। इस प्रतिकृति डेटा सेट में हमारे खोज मस्तिष्क विश्लेषण में पाए गए 8817 प्रोटीनों में से 8638 (98.0%) शामिल हैं, और नियंत्रण और एडी समूहों के बीच लगभग 3000 महत्वपूर्ण रूप से परिवर्तित प्रोटीन हैं (पी <0.05, विचरण के विश्लेषण के लिए तुकी के युग्मित टी परीक्षण के बाद) ( तालिका S2F). इन विभेदित रूप से व्यक्त प्रोटीनों में, 910 में एडी और मस्तिष्क प्रोटीओम नियंत्रण मामलों (पी <0.05, एनोवा तुकी युग्मित टी-परीक्षण के बाद) के बीच महत्वपूर्ण स्तर में बदलाव देखा गया। यह ध्यान देने योग्य है कि ये 910 मार्कर प्रोटीओम (आर = 0.94, पी <1.0 × 10-200) (चित्र एस3ए) के बीच परिवर्तन की दिशा में अत्यधिक सुसंगत हैं। बढ़े हुए प्रोटीनों में, डेटा सेट के बीच सबसे लगातार परिवर्तन वाले प्रोटीन मुख्य रूप से ग्लियाल-समृद्ध M5 और M18 मॉड्यूल (MDK, COL25A1, MAPT, NTN1, SMOC1, और GFAP) के सदस्य हैं। कम किए गए प्रोटीनों में, सबसे लगातार परिवर्तन वाले प्रोटीन लगभग विशेष रूप से सिनैप्स से जुड़े एम1 मॉड्यूल (एनपीटीएक्स2, वीजीएफ, और आरपीएच3ए) के सदस्य थे। हमने वेस्टर्न ब्लॉटिंग (चित्र S3B) द्वारा मिडकाइन (एमडीके), सीडी44, स्रावित फ्रिजल्ड-संबंधित प्रोटीन 1 (एसएफआरपी1) और वीजीएफ के एडी-संबंधित परिवर्तनों को और सत्यापित किया। मॉड्यूल संरक्षण विश्लेषण से पता चला कि मस्तिष्क प्रोटिओम में लगभग 80% प्रोटीन मॉड्यूल (34/44) प्रतिकृति डेटा सेट (जेड-स्कोर> 1.96, एफडीआर सही पी <0.05) (चित्रा एस3सी) में महत्वपूर्ण रूप से संरक्षित थे। इनमें से चौदह मॉड्यूल विशेष रूप से दो प्रोटिओम (जेड-स्कोर> 10, एफडीआर सही पी <1.0 × 10−23) के बीच आरक्षित थे। कुल मिलाकर, मस्तिष्क प्रोटीओम के बीच विभेदक अभिव्यक्ति और मॉड्यूलर संरचना में उच्च स्तर की स्थिरता की खोज और प्रतिकृति एडी फ्रंटल कॉर्टेक्स प्रोटीन में परिवर्तनों की प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्यता पर प्रकाश डालती है। इसके अलावा, यह भी पुष्टि की गई कि AsymAD और अधिक उन्नत बीमारियों की मस्तिष्क नेटवर्क संरचना बिल्कुल समान है।
मस्तिष्क प्रतिकृति डेटा सेट में अंतर अभिव्यक्ति का अधिक विस्तृत विश्लेषण AsymAD प्रोटीन परिवर्तनों की महत्वपूर्ण डिग्री पर प्रकाश डालता है, जिसमें AsymAD और नियंत्रण (P <0.05) (चित्रा S3D) के बीच कुल 151 महत्वपूर्ण रूप से परिवर्तित प्रोटीन शामिल हैं। अमाइलॉइड लोड के अनुरूप, AsymAD और AD के मस्तिष्क में APP में काफी वृद्धि हुई। एमएपीटी केवल एडी में महत्वपूर्ण रूप से बदलता है, जो उलझनों के बढ़े हुए स्तर और संज्ञानात्मक गिरावट (5, 7) के साथ इसके ज्ञात सहसंबंध के अनुरूप है। ग्लियाल-रिच मॉड्यूल (M5 और M18) AsymAD में बढ़े हुए प्रोटीन में अत्यधिक परिलक्षित होते हैं, जबकि न्यूरॉन-संबंधित M1 मॉड्यूल AsymAD में घटे हुए प्रोटीन का सबसे अधिक प्रतिनिधि है। इनमें से कई AsymAD मार्कर रोगसूचक रोगों में अधिक परिवर्तन दिखाते हैं। इन मार्करों में SMOC1, M18 से संबंधित एक ग्लियाल प्रोटीन है, जो मस्तिष्क ट्यूमर और आंखों और अंगों के विकास से जुड़ा है (32)। एमडीके कोशिका वृद्धि और एंजियोजेनेसिस (33) से संबंधित एक हेपरिन-बाध्यकारी वृद्धि कारक है, जो एम18 का एक अन्य सदस्य है। नियंत्रण समूह की तुलना में, AsymAD में उल्लेखनीय वृद्धि हुई, जिसके बाद AD में अधिक वृद्धि हुई। इसके विपरीत, AsymAD मस्तिष्क में सिनैप्टिक प्रोटीन न्यूरोपेंट्रैक्सिन 2 (NPTX2) काफी कम हो गया था। एनपीटीएक्स2 पहले न्यूरोडीजेनेरेशन से जुड़ा था और उत्तेजक सिनैप्स (34) की मध्यस्थता में इसकी एक मान्यता प्राप्त भूमिका है। कुल मिलाकर, ये परिणाम एडी में विभिन्न प्रीक्लिनिकल प्रोटीन परिवर्तनों को प्रकट करते हैं जो रोग की गंभीरता के साथ बढ़ते प्रतीत होते हैं।
यह देखते हुए कि हमने मस्तिष्क प्रोटीओम की खोज में प्रोटीन कवरेज की एक महत्वपूर्ण गहराई हासिल कर ली है, हम नेटवर्क-स्तरीय एडी ट्रांस्क्रिप्टोम के साथ इसके ओवरलैप को और अधिक पूरी तरह से समझने की कोशिश कर रहे हैं। इसलिए, हमने खोजे गए मस्तिष्क प्रोटिओम की तुलना उस मॉड्यूल से की, जो हमने पहले एडी (एन = 308) और नियंत्रण (एन = 157) डीएलपीएफसी ऊतकों (13) में 18,204 जीनों के माइक्रोएरे माप से उत्पन्न किया था। ओवरलैपिंग. कुल मिलाकर, हमने 20 अलग-अलग आरएनए मॉड्यूल की पहचान की, जिनमें से कई ने न्यूरॉन्स, ऑलिगोडेंड्रोसाइट्स, एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिया (चित्रा 3 ए) सहित विशिष्ट सेल प्रकारों के संवर्धन का प्रदर्शन किया। AD में इन मॉड्यूल के कई बदलाव चित्र 3बी में दिखाए गए हैं। गहरे बिना लेबल वाले एमएस प्रोटिओम (लगभग 3000 प्रोटीन) (13) का उपयोग करके हमारे पिछले प्रोटीन-आरएनए ओवरलैप विश्लेषण के अनुरूप, हमने पाया कि मस्तिष्क प्रोटिओम नेटवर्क में 44 मॉड्यूल में से अधिकांश ट्रांसक्रिपटोम नेटवर्क में हैं, इसमें कोई महत्वपूर्ण ओवरलैप नहीं है। हमारी खोज और 34 प्रोटीन मॉड्यूल की प्रतिकृति जो मस्तिष्क प्रोटीओम में अत्यधिक बरकरार हैं, केवल 14 (~40%) ने फिशर का सटीक परीक्षण (एफईटी) पास किया है, जो ट्रांसक्रिप्टोम (चित्रा 3 ए) के साथ सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण ओवरलैप साबित हुआ है। डीएनए क्षति मरम्मत (पी-एम25 और पी-एम19), प्रोटीन अनुवाद (पी-एम7 और पी-एम20), आरएनए बाइंडिंग/स्प्लिसिंग (पी-एम16 और पी-एम21) और प्रोटीन लक्ष्यीकरण (पी-एम13 और पी-) के साथ संगत। एम23) ट्रांस्क्रिप्टोम में मॉड्यूल के साथ ओवरलैप नहीं होता है। इसलिए, हालांकि वर्तमान ओवरलैप विश्लेषण (13) में एक गहरे प्रोटिओम डेटा सेट का उपयोग किया जाता है, अधिकांश एडी नेटवर्क प्रोटिओम को ट्रांसक्रिप्टोम नेटवर्क पर मैप नहीं किया जाता है।
(ए) हाइपरजियोमेट्रिक एफईटी एडी ट्रांस्क्रिप्टोम (शीर्ष) के आरएनए मॉड्यूल में सेल प्रकार-विशिष्ट मार्करों के संवर्धन और एडी मस्तिष्क के आरएनए (एक्स-अक्ष) और प्रोटीन (वाई-अक्ष) मॉड्यूल के बीच ओवरलैप की डिग्री को दर्शाता है। (तल) । लाल छायांकन की तीव्रता शीर्ष पैनल में सेल प्रकारों के संवर्धन की डिग्री और निचले पैनल में मॉड्यूल के ओवरलैप की तीव्रता को इंगित करती है। तारांकन सांख्यिकीय महत्व (पी <0.05) दर्शाते हैं। (बी) प्रत्येक ट्रांस्क्रिप्टोम मॉड्यूल और एडी स्थिति के विशिष्ट जीन के बीच सहसंबंध की डिग्री। बाईं ओर के मॉड्यूल AD (नीला) के साथ सबसे अधिक नकारात्मक रूप से सहसंबद्ध हैं, और दाईं ओर के मॉड्यूल AD (लाल) के साथ सबसे अधिक सकारात्मक रूप से सहसंबद्ध हैं। लॉग-रूपांतरित बीएच-सही पी मान प्रत्येक सहसंबंध के सांख्यिकीय महत्व की डिग्री को इंगित करता है। (सी) साझा सेल प्रकार संवर्धन के साथ महत्वपूर्ण ओवरलैपिंग मॉड्यूल। (डी) ओवरलैपिंग मॉड्यूल में लेबल किए गए प्रोटीन (एक्स-अक्ष) और आरएनए (वाई-अक्ष) के लॉग2 गुना परिवर्तन का सहसंबंध विश्लेषण। प्रासंगिक पी मान के साथ पियर्सन सहसंबंध गुणांक प्रदर्शित किया गया है। सूक्ष्म, माइक्रोग्लिया; आकाशीय पिंड, एस्ट्रोसाइट्स। सीटी, नियंत्रण.
अधिकांश ओवरलैपिंग प्रोटीन और आरएनए मॉड्यूल समान सेल प्रकार संवर्धन प्रोफाइल और लगातार एडी परिवर्तन दिशाएं साझा करते हैं (चित्रा 3, बी और सी)। दूसरे शब्दों में, मस्तिष्क प्रोटिओम (पीएम 1) के सिनैप्स-संबंधित एम 1 मॉड्यूल को तीन न्यूरोनल-समृद्ध समजात आरएनए मॉड्यूल (आर-एम 1, आर-एम 9 और आर-एम 16) में मैप किया गया है, जो एडी में हैं दोनों दिखाए गए हैं एक कम स्तर. इसी तरह, ग्लियाल-समृद्ध एम5 और एम18 प्रोटीन मॉड्यूल एस्ट्रोसाइट्स और माइक्रोग्लिअल मार्कर (आर-एम3, आर-एम7, और आर-एम10) से समृद्ध आरएनए मॉड्यूल के साथ ओवरलैप होते हैं और बीमारियों में अत्यधिक शामिल होते हैं। दो डेटा सेटों के बीच ये साझा मॉड्यूलर विशेषताएं कोशिका प्रकार संवर्धन और रोग-संबंधी परिवर्तनों का समर्थन करती हैं जो हमने मस्तिष्क प्रोटिओम में देखे हैं। हालाँकि, हमने इन साझा मॉड्यूल में व्यक्तिगत मार्करों के आरएनए और प्रोटीन स्तरों के बीच कई महत्वपूर्ण अंतर देखे। इन ओवरलैपिंग मॉड्यूल (चित्र 3डी) के भीतर अणुओं के प्रोटिओमिक्स और ट्रांसक्रिपटॉमिक्स की विभेदक अभिव्यक्ति का सहसंबंध विश्लेषण इस असंगतता को उजागर करता है। उदाहरण के लिए, एपीपी और कई अन्य ग्लियाल मॉड्यूल प्रोटीन (एनटीएन1, एमडीके, सीओएल25ए1, आईसीएएम1 और एसएफआरपी1) ने एडी प्रोटिओम में उल्लेखनीय वृद्धि देखी, लेकिन एडी ट्रांस्क्रिप्टोम में लगभग कोई बदलाव नहीं हुआ। ये प्रोटीन-विशिष्ट परिवर्तन अमाइलॉइड प्लाक (23, 35) से निकटता से संबंधित हो सकते हैं, जो प्रोटिओम को रोग संबंधी परिवर्तनों के स्रोत के रूप में उजागर करते हैं, और ये परिवर्तन ट्रांसक्रिप्टोम में परिलक्षित नहीं हो सकते हैं।
स्वतंत्र रूप से खोजे गए मस्तिष्क और सीएसएफ प्रोटीओम का विश्लेषण करने के बाद, हमने मस्तिष्क नेटवर्क के पैथोफिजियोलॉजी से संबंधित एडी सीएसएफ बायोमार्कर की पहचान करने के लिए दो डेटा सेटों का व्यापक विश्लेषण किया। हमें पहले दो प्रोटिओम के ओवरलैप को परिभाषित करना होगा। यद्यपि यह व्यापक रूप से स्वीकार किया जाता है कि सीएसएफ एडी मस्तिष्क (4) में न्यूरोकेमिकल परिवर्तनों को दर्शाता है, एडी मस्तिष्क और सीएसएफ प्रोटिओम के बीच ओवरलैप की सटीक डिग्री स्पष्ट नहीं है। हमारे दो प्रोटीओम में पाए गए साझा जीन उत्पादों की संख्या की तुलना करके, हमने पाया कि मस्तिष्कमेरु द्रव में पहचाने गए प्रोटीन का लगभग 70% (एन = 1936) मस्तिष्क में भी मात्रा में निर्धारित किया गया था (चित्रा 4 ए)। इनमें से अधिकांश ओवरलैपिंग प्रोटीन (एन = 1721) को डिस्कवरी ब्रेन डेटा सेट (चित्र 4बी) से 44 सह-अभिव्यक्ति मॉड्यूल में से एक में मैप किया गया है। जैसा कि अपेक्षित था, छह सबसे बड़े मस्तिष्क मॉड्यूल (एम1 से एम6) ने सीएसएफ ओवरलैप की सबसे बड़ी मात्रा प्रदर्शित की। हालाँकि, छोटे मस्तिष्क मॉड्यूल हैं (उदाहरण के लिए, एम15 और एम29) जो अप्रत्याशित रूप से उच्च स्तर का ओवरलैप प्राप्त करते हैं, जो अपने आकार से दोगुने मस्तिष्क मॉड्यूल से बड़ा होता है। यह हमें मस्तिष्क और मस्तिष्कमेरु द्रव के बीच ओवरलैप की गणना करने के लिए अधिक विस्तृत, सांख्यिकीय रूप से संचालित विधि अपनाने के लिए प्रेरित करता है।
(ए और बी) खोज मस्तिष्क और सीएसएफ डेटा सेट में पाए गए प्रोटीन ओवरलैप होते हैं। इनमें से अधिकांश ओवरलैपिंग प्रोटीन मस्तिष्क सह-अभिव्यक्ति नेटवर्क के 44 सह-अभिव्यक्ति मॉड्यूल में से एक से जुड़े हुए हैं। (सी) मस्तिष्कमेरु द्रव प्रोटिओम और मस्तिष्क नेटवर्क प्रोटिओम के बीच ओवरलैप की खोज करें। हीट मैप की प्रत्येक पंक्ति हाइपरज्यामितीय FET के एक अलग ओवरलैप विश्लेषण का प्रतिनिधित्व करती है। शीर्ष पंक्ति मस्तिष्क मॉड्यूल और संपूर्ण सीएसएफ प्रोटिओम के बीच ओवरलैप (ग्रे/ब्लैक शेडिंग) को दर्शाती है। दूसरी पंक्ति दर्शाती है कि मस्तिष्क मॉड्यूल और सीएसएफ प्रोटीन (लाल रंग में छायांकित) के बीच ओवरलैप एडी (पी <0.05) में काफी हद तक विनियमित है। तीसरी पंक्ति से पता चलता है कि मस्तिष्क मॉड्यूल और सीएसएफ प्रोटीन (नीली छाया) के बीच ओवरलैप एडी (पी <0.05) में काफी कम-विनियमित है। FET से प्राप्त P मान को सही करने के लिए BH विधि का उपयोग करें। (डी) सेल प्रकार एसोसिएशन और संबंधित जीओ शर्तों के आधार पर फोल्डिंग मॉड्यूल पैनल। इन पैनलों में मस्तिष्क से संबंधित कुल 271 प्रोटीन होते हैं, जिनकी सीएसएफ प्रोटिओम में सार्थक अंतर अभिव्यक्ति होती है।
एकल-पूंछ वाले एफईटी का उपयोग करके, हमने सीएसएफ प्रोटिओम और व्यक्तिगत मस्तिष्क मॉड्यूल के बीच प्रोटीन ओवरलैप के महत्व का आकलन किया। विश्लेषण से पता चला कि सीएसएफ डेटा सेट में कुल 14 मस्तिष्क मॉड्यूल में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण ओवरलैप (एफडीआर समायोजित पी <0.05) है, और एक अतिरिक्त मॉड्यूल (एम 18) जिसका ओवरलैप महत्व के करीब है (एफडीआर समायोजित पी = 0.06) (चित्रा 4सी) , सबसे ऊपर की कतार)। हम उन मॉड्यूलों में भी रुचि रखते हैं जो विभेदित रूप से व्यक्त सीएसएफ प्रोटीन के साथ दृढ़ता से ओवरलैप करते हैं। इसलिए, हमने यह निर्धारित करने के लिए दो अतिरिक्त एफईटी विश्लेषण लागू किए कि (i) सीएसएफ प्रोटीन एडी में काफी बढ़ गया था और (ii) सीएसएफ प्रोटीन एडी में काफी कम हो गया था (पी <0.05, युग्मित टी परीक्षण एडी/नियंत्रण) सार्थक ओवरलैप के साथ मस्तिष्क मॉड्यूल उन दोनों के बीच। जैसा कि चित्र 4C की मध्य और निचली पंक्तियों में दिखाया गया है, ये अतिरिक्त विश्लेषण दर्शाते हैं कि 44 मस्तिष्क मॉड्यूल में से 8 AD CSF (M12, M1, M2, M18, M5, M44, M33, और M38) में जोड़े गए प्रोटीन के साथ महत्वपूर्ण रूप से ओवरलैप होते हैं। . ), जबकि केवल दो मॉड्यूल (एम6 और एम15) ने एडी सीएसएफ में कम प्रोटीन के साथ एक सार्थक ओवरलैप दिखाया। जैसा कि अपेक्षित था, सभी 10 मॉड्यूल सीएसएफ प्रोटिओम के साथ उच्चतम ओवरलैप वाले 15 मॉड्यूल में हैं। इसलिए, हम मानते हैं कि ये 15 मॉड्यूल एडी मस्तिष्क-व्युत्पन्न सीएसएफ बायोमार्कर के उच्च-उपज स्रोत हैं।
हमने WGCNA ट्री आरेख में उनकी निकटता और सेल प्रकार और जीन ऑन्टोलॉजी (चित्र 4D) के साथ उनके जुड़ाव के आधार पर इन 15 ओवरलैपिंग मॉड्यूल को पांच बड़े प्रोटीन पैनलों में बदल दिया। पहले पैनल में न्यूरॉन मार्कर और सिनैप्स-संबंधित प्रोटीन (एम1 और एम12) से भरपूर मॉड्यूल शामिल हैं। सिनैप्टिक पैनल में कुल 94 प्रोटीन होते हैं, और सीएसएफ प्रोटिओम का स्तर काफी बदल गया है, जिससे यह पांच पैनलों के बीच मस्तिष्क से संबंधित सीएसएफ मार्करों का सबसे बड़ा स्रोत बन गया है। दूसरे समूह (एम6 और एम15) ने एंडोथेलियल सेल मार्करों और संवहनी शरीर के साथ घनिष्ठ संबंध का प्रदर्शन किया, जैसे "घाव भरना" (एम6) और "ह्यूमरल प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का विनियमन" (एम15)। एम15 लिपोप्रोटीन चयापचय से भी अत्यधिक संबंधित है, जो एंडोथेलियम (36) से निकटता से संबंधित है। संवहनी पैनल में मस्तिष्क से संबंधित 34 सीएसएफ मार्कर होते हैं। तीसरे समूह में मॉड्यूल (एम2 और एम4) शामिल हैं जो ऑलिगोडेंड्रोसाइट मार्करों और कोशिका प्रसार से महत्वपूर्ण रूप से संबंधित हैं। उदाहरण के लिए, एम2 के शीर्ष-स्तरीय ऑन्टोलॉजी शब्दों में "डीएनए प्रतिकृति का सकारात्मक विनियमन" और "प्यूरीन बायोसिंथेसिस प्रक्रिया" शामिल हैं। इस बीच, एम4 में "ग्लिअल सेल विभेदन" और "क्रोमोसोम पृथक्करण" शामिल हैं। माइलिनेशन पैनल में मस्तिष्क से संबंधित 49 सीएसएफ मार्कर होते हैं।
चौथे समूह में सबसे अधिक मॉड्यूल (M30, M29, M18, M24, और M5) शामिल हैं, और लगभग सभी मॉड्यूल माइक्रोग्लिया और एस्ट्रोसाइट मार्करों में काफी समृद्ध हैं। माइलिनेशन पैनल के समान, चौथे पैनल में भी मॉड्यूल (एम30, एम29, और एम18) शामिल हैं जो कोशिका प्रसार से निकटता से संबंधित हैं। इस समूह के अन्य मॉड्यूल प्रतिरक्षाविज्ञानी शब्दों से अत्यधिक संबंधित हैं, जैसे "प्रतिरक्षा प्रभाव प्रक्रिया" (एम5) और "प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया विनियमन" (एम24)। ग्लियाल प्रतिरक्षा समूह में मस्तिष्क से संबंधित 42 सीएसएफ मार्कर होते हैं। अंत में, अंतिम पैनल में चार मॉड्यूल (एम44, एम3, एम33 और एम38) पर 52 मस्तिष्क-संबंधित मार्कर शामिल हैं, जो सभी शरीर पर ऊर्जा भंडारण और चयापचय से संबंधित हैं। इनमें से सबसे बड़ा मॉड्यूल (एम3) माइटोकॉन्ड्रिया से निकटता से संबंधित है और न्यूरॉन-विशिष्ट मार्करों से समृद्ध है। एम38 इस चयापचय में छोटे मॉड्यूल सदस्यों में से एक है और मध्यम न्यूरॉन विशिष्टता भी प्रदर्शित करता है।
कुल मिलाकर, ये पांच पैनल एडी कॉर्टेक्स में सेल प्रकारों और कार्यों की एक विस्तृत श्रृंखला को दर्शाते हैं, और सामूहिक रूप से 271 मस्तिष्क से संबंधित सीएसएफ मार्कर (टेबल एस 2 जी) शामिल हैं। इन एमएस परिणामों की वैधता का मूल्यांकन करने के लिए, हमने निकटता विस्तार परख (पीईए) का उपयोग किया, जो मल्टीप्लेक्सिंग क्षमताओं, उच्च संवेदनशीलता और विशिष्टता के साथ एक ऑर्थोगोनल एंटीबॉडी-आधारित तकनीक है, और मस्तिष्कमेरु द्रव के नमूनों का पुन: विश्लेषण किया, जो हमें इन 271 बायोमार्कर का एक सबसेट मिला। (एन = 36). ये 36 लक्ष्य पीईए के एडी गुणक में परिवर्तन को प्रदर्शित करते हैं, जो हमारे एमएस-आधारित निष्कर्षों (आर = 0.87, पी = 5.6 × 10-12) से निकटता से संबंधित है, जिसने हमारे व्यापक एमएस विश्लेषण (चित्र एस4) के परिणामों को दृढ़ता से सत्यापित किया है। ).
सिनैप्टिक सिग्नलिंग से लेकर ऊर्जा चयापचय तक, हमारे पांच समूहों द्वारा जिन जैविक विषयों पर जोर दिया गया है, वे सभी AD (1-3) के रोगजनन से संबंधित हैं। इसलिए, इन पैनलों वाले सभी 15 मॉड्यूल मस्तिष्क प्रोटिओम में एडी पैथोलॉजी से संबंधित हैं जिन्हें हमने खोजा था (चित्र 2बी)। सबसे उल्लेखनीय हमारे ग्लियाल मॉड्यूल के बीच उच्च सकारात्मक पैथोलॉजिकल सहसंबंध और हमारे सबसे बड़े न्यूरोनल मॉड्यूल (एम 1 और एम 3) के बीच मजबूत नकारात्मक पैथोलॉजिकल सहसंबंध है। हमारे प्रतिकृति मस्तिष्क प्रोटिओम (चित्र S3D) का विभेदक अभिव्यक्ति विश्लेषण भी M5 और M18-व्युत्पन्न ग्लियाल प्रोटीन पर प्रकाश डालता है। AsymAD और रोगसूचक AD में, ग्लियाल प्रोटीन सबसे अधिक बढ़ता है और M1-संबंधित सिनैप्स प्रोटीन सबसे अधिक कम होता है। इन अवलोकनों से संकेत मिलता है कि हमने पांच समूहों में जिन 271 मस्तिष्कमेरु द्रव मार्करों की पहचान की है, वे एडी कॉर्टेक्स में रोग प्रक्रियाओं से संबंधित हैं, जिनमें प्रारंभिक स्पर्शोन्मुख चरणों में होने वाली प्रक्रियाएं भी शामिल हैं।
मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के तरल पदार्थ में पैनल प्रोटीन की परिवर्तन दिशा का बेहतर विश्लेषण करने के लिए, हमने 15 ओवरलैपिंग मॉड्यूल में से प्रत्येक के लिए निम्नलिखित चित्र बनाए: (i) मस्तिष्क डेटा सेट में मॉड्यूल प्रचुरता स्तर पाया और (ii) मॉड्यूल प्रोटीन अंतर मस्तिष्कमेरु द्रव (चित्र S5) में व्यक्त किया गया है। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, WGCNA का उपयोग मस्तिष्क में मॉड्यूल बहुतायत या विशेषता प्रोटीन मूल्य निर्धारित करने के लिए किया जाता है (13)। ज्वालामुखी मानचित्र का उपयोग मस्तिष्कमेरु द्रव (एडी/नियंत्रण) में मॉड्यूलर प्रोटीन की विभेदक अभिव्यक्ति का वर्णन करने के लिए किया जाता है। ये आंकड़े बताते हैं कि पांच में से तीन पैनल मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के तरल पदार्थ में अलग-अलग अभिव्यक्ति के रुझान दिखाते हैं। सिनैप्स पैनल (एम1 और एम12) के दो मॉड्यूल एडी मस्तिष्क में प्रचुरता स्तर में कमी दिखाते हैं, लेकिन एडी सीएसएफ (चित्र एस5ए) में बढ़े हुए प्रोटीन के साथ महत्वपूर्ण रूप से ओवरलैप होते हैं। मेटाबोलोम (एम3 और एम38) वाले न्यूरॉन-संबंधित मॉड्यूल ने समान मस्तिष्क और मस्तिष्कमेरु द्रव अभिव्यक्ति पैटर्न को असंगत दिखाया (चित्र S5E)। संवहनी पैनल ने भी अलग-अलग अभिव्यक्ति के रुझान दिखाए, हालांकि इसके मॉड्यूल (एम 6 और एम 15) एडी मस्तिष्क में मामूली रूप से बढ़े हुए थे और रोगग्रस्त सीएसएफ (चित्रा एस 5 बी) में कम हो गए थे। शेष दो पैनलों में बड़े ग्लियाल नेटवर्क होते हैं जिनके प्रोटीन दोनों डिब्बों में लगातार विनियमित होते हैं (चित्र S5, C और D)।
कृपया ध्यान दें कि ये रुझान इन पैनलों के सभी मार्करों के लिए सामान्य नहीं हैं। उदाहरण के लिए, सिनैप्टिक पैनल में कई प्रोटीन शामिल होते हैं जो AD मस्तिष्क और CSF (चित्रा S5A) में काफी कम हो जाते हैं। इन डाउन-रेगुलेटेड सेरेब्रोस्पाइनल द्रव मार्करों में एम1 के एनपीटीएक्स2 और वीजीएफ और एम12 के क्रोमोग्रानिन बी हैं। हालाँकि, इन अपवादों के बावजूद, हमारे अधिकांश सिनैप्टिक मार्कर एडी स्पाइनल द्रव में ऊंचे हैं। कुल मिलाकर, ये विश्लेषण हमारे पांच पैनलों में से प्रत्येक में मस्तिष्क और मस्तिष्कमेरु द्रव के स्तर में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण रुझानों को अलग करने में सक्षम थे। ये रुझान एडी में मस्तिष्क और सीएसएफ प्रोटीन अभिव्यक्ति के बीच जटिल और अक्सर भिन्न संबंधों को उजागर करते हैं।
फिर, हमने बायोमार्कर के हमारे 271 सेट को सबसे आशाजनक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य लक्ष्य (चित्रा 5 ए) तक सीमित करने के लिए उच्च-थ्रूपुट एमएस प्रतिकृति विश्लेषण (सीएसएफ प्रतिकृति 1) का उपयोग किया। सीएसएफ कॉपी 1 में एमोरी गोइज़ुएटा एडीआरसी से कुल 96 नमूने शामिल हैं, जिनमें नियंत्रण, एसिमैड और एडी कोहोर्ट (तालिका एस1ए) शामिल हैं। इन AD मामलों की विशेषता हल्के संज्ञानात्मक गिरावट (औसत MoCA, 20.0 ± 3.8) और मस्तिष्कमेरु द्रव (तालिका S1A) में पुष्टि किए गए AD बायोमार्कर में परिवर्तन हैं। हमने पाया कि सीएसएफ विश्लेषण के विपरीत, यह प्रतिकृति एक अधिक कुशल और उच्च-थ्रूपुट "सिंगल-शॉट" एमएस विधि (ऑफ-लाइन फ्रैक्शनेशन के बिना) का उपयोग करके की जाती है, जिसमें एक सरलीकृत नमूना तैयारी प्रोटोकॉल शामिल है जो व्यक्तिगत नमूनों की प्रतिरक्षाविहीनता की आवश्यकता को समाप्त करता है। . इसके बजाय, कम प्रचुर मात्रा में प्रोटीन (37) के संकेत को बढ़ाने के लिए एक एकल प्रतिरक्षा-क्षीण "वृद्धि चैनल" का उपयोग किया जाता है। यद्यपि यह कुल प्रोटीओम कवरेज को कम करता है, यह एकल-शॉट विधि मशीन के समय को काफी कम कर देती है और टीएमटी-लेबल नमूनों की संख्या बढ़ा देती है जिनका व्यवहार्य विश्लेषण किया जा सकता है (17, 38)। कुल मिलाकर, विश्लेषण ने 6,487 पेप्टाइड्स की पहचान की, जो 96 मामलों में 1,183 प्रोटिओम तक मैप किए गए। जैसा कि सीएसएफ विश्लेषण में हमने पाया, केवल कम से कम 50% नमूनों में मात्रा निर्धारित प्रोटीन को बाद की गणना में शामिल किया गया था, और उम्र और लिंग के प्रभावों के लिए डेटा को पुनः प्राप्त किया गया था। इससे 792 प्रोटीओम की अंतिम मात्रा निर्धारित हुई, जिनमें से 95% की पहचान सीएसएफ डेटा सेट में भी की गई थी।
(ए) मस्तिष्क से संबंधित सीएसएफ प्रोटीन लक्ष्य पहले प्रतिकृति सीएसएफ समूह में सत्यापित किए गए और अंतिम पैनल (एन = 60) में शामिल किए गए। (बी से ई) पैनल बायोमार्कर स्तर (समग्र जेड-स्कोर) चार सीएसएफ प्रतिकृति समूहों में मापा जाता है। प्रत्येक प्रतिकृति विश्लेषण में प्रचुर मात्रा में परिवर्तनों के सांख्यिकीय महत्व का मूल्यांकन करने के लिए तुकी के सुधार के बाद युग्मित टी-परीक्षण या एनोवा का उपयोग किया गया था। सीटी, नियंत्रण.
चूँकि हम व्यापक विश्लेषण के माध्यम से अपने 271 मस्तिष्क-संबंधित सीएसएफ लक्ष्यों को सत्यापित करने में विशेष रूप से रुचि रखते हैं, इसलिए हम इस प्रतिकृति प्रोटिओम की आगे की जांच को इन मार्करों तक सीमित कर देंगे। इन 271 प्रोटीनों में से, 100 सीएसएफ प्रतिकृति 1 में पाए गए। चित्र एस6ए नियंत्रण और एडी प्रतिकृति नमूनों के बीच इन 100 ओवरलैपिंग मार्करों की अंतर अभिव्यक्ति को दर्शाता है। एडी में सिनैप्टिक और मेटाबोलाइट हिस्टोन सबसे अधिक बढ़ते हैं, जबकि रोग में संवहनी प्रोटीन सबसे अधिक कम हो जाते हैं। 100 ओवरलैपिंग मार्करों (एन = 70) में से अधिकांश ने दो डेटा सेटों में परिवर्तन की समान दिशा बनाए रखी (चित्रा एस6बी)। ये 70 मान्य मस्तिष्क-संबंधित सीएसएफ मार्कर (तालिका एस2एच) बड़े पैमाने पर पहले देखे गए पैनल अभिव्यक्ति रुझानों को दर्शाते हैं, यानी, संवहनी प्रोटीन का डाउन-रेगुलेशन और अन्य सभी पैनलों का अप-रेगुलेशन। इन 70 मान्य प्रोटीनों में से केवल 10 में एडी प्रचुरता में बदलाव दिखे जो इन पैनल रुझानों के विपरीत थे। एक पैनल तैयार करने के लिए जो मस्तिष्क और मस्तिष्कमेरु द्रव की समग्र प्रवृत्ति को सबसे अच्छी तरह से दर्शाता है, हमने इन 10 प्रोटीनों को रुचि के पैनल से बाहर कर दिया, जिन्हें हमने अंततः सत्यापित किया (चित्रा 5 ए)। इसलिए, हमारे पैनल में अंततः विभिन्न नमूना तैयारी और एमएस प्लेटफ़ॉर्म विश्लेषण का उपयोग करके दो स्वतंत्र सीएसएफ एडी समूहों में सत्यापित कुल 60 प्रोटीन शामिल हैं। सीएसएफ कॉपी 1 नियंत्रण और एडी मामलों में इन अंतिम पैनलों के जेड-स्कोर अभिव्यक्ति प्लॉट ने सीएसएफ समूह में देखे गए पैनल प्रवृत्ति की पुष्टि की, जो हमें मिला (चित्र 5बी)।
इन 60 प्रोटीनों में, ऐसे अणु हैं जिन्हें AD से संबद्ध माना जाता है, जैसे ऑस्टियोपॉन्टिन (SPP1), जो एक प्रो-इंफ्लेमेटरी साइटोकिन है जिसे कई अध्ययनों (39-41) में AD से संबद्ध किया गया है, और GAP43, एक सिनैप्टिक प्रोटीन यह स्पष्ट रूप से न्यूरोडीजेनेरेशन (42) से जुड़ा हुआ है। सबसे पूरी तरह से सत्यापित प्रोटीन अन्य न्यूरोडीजेनेरेटिव रोगों से संबंधित मार्कर हैं, जैसे एमियोट्रोफिक लेटरल स्क्लेरोसिस (एएलएस) संबंधित सुपरऑक्साइड डिसम्यूटेज 1 (एसओडी1) और पार्किंसंस रोग संबंधित डेसैकेरेज़ (PARK7)। हमने यह भी सत्यापित किया है कि कई अन्य मार्कर, जैसे कि SMOC1 और मस्तिष्क-समृद्ध झिल्ली अनुलग्नक सिग्नलिंग प्रोटीन 1 (BASP1), ने न्यूरोडीजेनेरेशन के पिछले लिंक को सीमित कर दिया है। यह ध्यान देने योग्य है कि सीएसएफ प्रोटिओम में उनकी कम समग्र प्रचुरता के कारण, हमारे लिए एमएपीटी और कुछ अन्य एडी-संबंधित प्रोटीन (उदाहरण के लिए, एनईएफएल और एनआरजीएन) का विश्वसनीय रूप से पता लगाने के लिए इस उच्च-थ्रूपुट सिंगल-शॉट डिटेक्शन विधि का उपयोग करना मुश्किल है। ) (43,44).
फिर हमने तीन अतिरिक्त प्रतिकृति विश्लेषणों में इन 60 प्राथमिकता पैनल मार्करों की जाँच की। सीएसएफ कॉपी 2 में, हमने एमोरी गोइज़ुएटा एडीआरसी (17) से 297 नियंत्रण और एडी नमूनों के एक स्वतंत्र समूह का विश्लेषण करने के लिए एक एकल टीएमटी-एमएस का उपयोग किया। सीएसएफ प्रतिकृति 3 में लॉज़ेन, स्विट्जरलैंड (45) के 120 नियंत्रण और एडी रोगियों से उपलब्ध टीएमटी-एमएस डेटा का पुनर्विश्लेषण शामिल था। हमने प्रत्येक डेटासेट में 60 प्राथमिकता मार्करों में से दो-तिहाई से अधिक का पता लगाया। हालाँकि स्विस अध्ययन में विभिन्न एमएस प्लेटफार्मों और टीएमटी परिमाणीकरण विधियों (45, 46) का उपयोग किया गया था, हमने दो बार दोहराए गए विश्लेषणों (चित्र 5, सी और डी, और टेबल्स एस2, आई, और जे) में अपने पैनल रुझानों को दृढ़ता से दोहराया। हमारे समूह की रोग विशिष्टता का मूल्यांकन करने के लिए, हमने चौथे प्रतिकृति डेटा सेट (सीएसएफ प्रतिकृति 4) का विश्लेषण करने के लिए टीएमटी-एमएस का उपयोग किया, जिसमें न केवल नियंत्रण (एन = 18) और एडी (एन = 17) मामले शामिल थे, बल्कि पीडी ( एन = 14)), एएलएस (एन = 18) और फ्रंटोटेम्पोरल डिमेंशिया (एफटीडी) नमूने (एन = 11) (तालिका एस1ए)। हमने इस समूह में लगभग दो-तिहाई पैनल प्रोटीन (60 में से 38) को सफलतापूर्वक निर्धारित किया। ये परिणाम सभी पांच बायोमार्कर पैनलों (चित्रा 5ई और तालिका एस2के) में एडी-विशिष्ट परिवर्तनों को उजागर करते हैं। मेटाबोलाइट समूह में वृद्धि ने सबसे मजबूत एडी विशिष्टता दिखाई, इसके बाद माइलिनेशन और ग्लियाल समूह का स्थान आया। कुछ हद तक, एफटीडी भी इन पैनलों के बीच वृद्धि दर्शाता है, जो समान संभावित नेटवर्क परिवर्तनों (17) को प्रतिबिंबित कर सकता है। इसके विपरीत, एएलएस और पीडी ने नियंत्रण समूह के समान ही माइलिनेशन, ग्लियाल और मेटाबोलोम प्रोफाइल दिखाया। कुल मिलाकर, नमूना तैयार करने, एमएस प्लेटफ़ॉर्म और टीएमटी मात्रा निर्धारण विधियों में अंतर के बावजूद, इन बार-बार किए गए विश्लेषणों से पता चलता है कि हमारे प्राथमिकता पैनल मार्करों में 500 से अधिक अद्वितीय सीएसएफ नमूनों में अत्यधिक सुसंगत एडी-विशिष्ट परिवर्तन हैं।
संज्ञानात्मक लक्षणों की शुरुआत से कई साल पहले AD न्यूरोडीजेनेरेशन को व्यापक रूप से मान्यता दी गई है, इसलिए AsymAD (5, 31) के बायोमार्कर की तत्काल आवश्यकता है। हालाँकि, अधिक से अधिक सबूत बताते हैं कि AsymAD की जीवविज्ञान सजातीय से बहुत दूर है, और जोखिम और लचीलेपन की जटिल बातचीत बाद की बीमारी की प्रगति में बड़े व्यक्तिगत अंतर की ओर ले जाती है (47)। यद्यपि AsymAD मामलों की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है, कोर CSF बायोमार्कर (Aβ1-42, कुल ताऊ और पी-ताउ) का स्तर विश्वसनीय रूप से भविष्यवाणी करने में सक्षम साबित नहीं हुआ है कि कौन मनोभ्रंश (4, 7) में प्रगति करेगा, यह और अधिक संकेत दे सकता है इस जनसंख्या के जोखिम को सटीक रूप से स्तरीकृत करने के लिए मस्तिष्क शरीर क्रिया विज्ञान के कई पहलुओं पर आधारित समग्र बायोमार्कर उपकरण शामिल करना आवश्यक है। इसलिए, हमने बाद में CSF कॉपी 1 की AsymAD जनसंख्या में हमारे AD-मान्य बायोमार्कर पैनल का विश्लेषण किया। इन 31 AsymAD मामलों में असामान्य कोर बायोमार्कर स्तर (Aβ1–42/कुल ताऊ ELISA अनुपात, <5.5) और पूर्ण अनुभूति (मतलब MoCA, 27.1) दिखाई दी। ± 2.2) (तालिका एस1ए)। इसके अलावा, AsymAD वाले सभी व्यक्तियों का क्लिनिकल डिमेंशिया स्कोर 0 है, जो दर्शाता है कि दैनिक संज्ञानात्मक या कार्यात्मक प्रदर्शन में गिरावट का कोई सबूत नहीं है।
हमने सबसे पहले AsymAD समूह सहित सभी 96 CSF प्रतिकृति 1 में मान्य पैनलों के स्तर का विश्लेषण किया। हमने पाया कि AsymAD समूह के कई पैनलों में महत्वपूर्ण AD-जैसे बहुतायत परिवर्तन थे, संवहनी पैनल ने AsymAD में नीचे की ओर प्रवृत्ति दिखाई, जबकि अन्य सभी पैनलों ने ऊपर की ओर प्रवृत्ति दिखाई (चित्र 6A)। इसलिए, सभी पैनलों ने एलिसा एβ1-42 और कुल ताऊ स्तरों (चित्र 6बी) के साथ अत्यधिक महत्वपूर्ण सहसंबंध दिखाया। इसके विपरीत, समूह और MoCA स्कोर के बीच संबंध अपेक्षाकृत खराब है। इन विश्लेषणों से सबसे महत्वपूर्ण निष्कर्षों में से एक AsymAD समूह में पैनल बहुतायत की बड़ी रेंज है। जैसा कि चित्र 6A में दिखाया गया है, AsymAD समूह का पैनल स्तर आमतौर पर नियंत्रण समूह और AD समूह के पैनल स्तर को पार करता है, जो अपेक्षाकृत उच्च परिवर्तनशीलता दर्शाता है। AsymAD की इस विविधता का और पता लगाने के लिए, हमने 96 CSF प्रतिकृति 1 मामलों में बहुआयामी स्केलिंग (MDS) विश्लेषण लागू किया। एमडीएस विश्लेषण डेटा सेट में कुछ चर के आधार पर मामलों के बीच समानता की कल्पना करने की अनुमति देता है। इस क्लस्टर विश्लेषण के लिए, हम केवल उन मान्य पैनल मार्करों का उपयोग करते हैं जिनमें सीएसएफ खोज और प्रतिकृति 1 प्रोटिओम (एन = 29) (तालिका एस2एल) स्तर में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण परिवर्तन (पी <0.05, एडी/नियंत्रण) है। इस विश्लेषण ने हमारे नियंत्रण और AD मामलों (चित्रा 6C) के बीच स्पष्ट स्थानिक क्लस्टरिंग उत्पन्न की। इसके विपरीत, कुछ AsymAD मामले स्पष्ट रूप से नियंत्रण समूह में क्लस्टर किए गए हैं, जबकि अन्य AD मामलों में स्थित हैं। इस AsymAD विविधता का और अधिक पता लगाने के लिए, हमने इन AsymAD मामलों के दो समूहों को परिभाषित करने के लिए अपने MDS मानचित्र का उपयोग किया। पहले समूह में नियंत्रण (n = 19) के करीब क्लस्टर किए गए AsymAD मामले शामिल थे, जबकि दूसरे समूह में AD (n = 12) के करीब मार्कर प्रोफ़ाइल वाले AsymAD मामले शामिल थे।
(ए) AsymAD सहित CSF प्रतिकृति 1 समूह में सभी 96 नमूनों में CSF बायोमार्कर समूह का अभिव्यक्ति स्तर (z-स्कोर)। पैनल बहुतायत परिवर्तनों के सांख्यिकीय महत्व का मूल्यांकन करने के लिए तुकी के पोस्ट-करेक्शन के साथ भिन्नता का विश्लेषण किया गया था। (बी) एमओसीए स्कोर और एलिसा एβ1-42 और सीएसएफ कॉपी 1 नमूनों में कुल ताऊ स्तर के साथ पैनल प्रोटीन बहुतायत स्तर (जेड-स्कोर) का सहसंबंध विश्लेषण। प्रासंगिक पी मान के साथ पियर्सन सहसंबंध गुणांक प्रदर्शित किया जाता है। (सी) 96 सीएसएफ कॉपी 1 मामलों का एमडीएस 29 मान्य पैनल मार्करों के बहुतायत स्तर पर आधारित था, जो खोज और सीएसएफ कॉपी 1 डेटा सेट [पी <0.05 एडी/नियंत्रण (सीटी)] दोनों में महत्वपूर्ण रूप से बदल गए थे। इस विश्लेषण का उपयोग AsymAD समूह को नियंत्रण (n = 19) और AD (n = 12) उपसमूहों में विभाजित करने के लिए किया गया था। (डी) ज्वालामुखी प्लॉट दो AsymAD उपसमूहों के बीच -लॉग10 सांख्यिकीय पी मान के सापेक्ष लॉग2 गुना परिवर्तन (एक्स-अक्ष) के साथ सभी सीएसएफ प्रतिकृति 1 प्रोटीन की अंतर अभिव्यक्ति को दर्शाता है। पैनल बायोमार्कर रंगीन हैं। (ई) सीएसएफ प्रतिकृति 1 चयन समूह बायोमार्कर का बहुतायत स्तर AsymAD उपसमूहों के बीच भिन्न रूप से व्यक्त किया जाता है। तुकी के विचरण के बाद के समायोजित विश्लेषण का उपयोग सांख्यिकीय महत्व का आकलन करने के लिए किया गया था।
हमने इन नियंत्रण और AD-जैसे AsymAD मामलों (चित्र 6D और तालिका S2L) के बीच अंतर प्रोटीन अभिव्यक्ति की जांच की। परिणामी ज्वालामुखी मानचित्र से पता चलता है कि दोनों समूहों के बीच 14 पैनल मार्कर महत्वपूर्ण रूप से बदल गए हैं। इनमें से अधिकांश मार्कर सिनैप्स और मेटाबोलोम के सदस्य हैं। हालाँकि, SOD1 और मिरिस्टॉयलेटेड एलानिन-समृद्ध प्रोटीन काइनेज सी सब्सट्रेट (MARCKS), जो क्रमशः माइलिन और ग्लियाल प्रतिरक्षा समूहों के सदस्य हैं, भी इस समूह से संबंधित हैं (चित्रा 6, डी और ई)। संवहनी पैनल ने दो मार्करों का भी योगदान दिया जो AD-जैसे AsymAD समूह में काफी कम हो गए थे, जिनमें AE बाइंडिंग प्रोटीन 1 (AEBP1) और पूरक परिवार के सदस्य C9 शामिल थे। ELISA AB1-42 (P = 0.38) और p-tau (P = 0.28) में नियंत्रण और AD-जैसे AsymAD उपसमूहों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था, लेकिन कुल tau स्तर (P = 0.0031) में वास्तव में एक महत्वपूर्ण अंतर था। ) (चित्र S7)। ऐसे कई पैनल मार्कर हैं जो इंगित करते हैं कि दो AsymAD उपसमूहों के बीच परिवर्तन कुल ताऊ स्तरों (उदाहरण के लिए, YWHAZ, SOD1, और MDH1) (चित्र 6E) से अधिक महत्वपूर्ण हैं। कुल मिलाकर, इन परिणामों से संकेत मिलता है कि हमारे मान्य पैनल में बायोमार्कर हो सकते हैं जो स्पर्शोन्मुख रोग वाले रोगियों के उपप्रकार और संभावित जोखिम स्तरीकरण कर सकते हैं।
एडी के पीछे विभिन्न पैथोफिज़ियोलॉजी को बेहतर ढंग से मापने और लक्षित करने के लिए सिस्टम-आधारित बायोमार्कर टूल की तत्काल आवश्यकता है। इन उपकरणों से न केवल हमारे एडी डायग्नोस्टिक ढांचे को बदलने की उम्मीद है, बल्कि प्रभावी, रोगी-विशिष्ट उपचार रणनीतियों (1, 2) को अपनाने को भी बढ़ावा मिलेगा। इस प्रयोजन के लिए, हमने वेब-आधारित सीएसएफ बायोमार्कर की पहचान करने के लिए एडी मस्तिष्क और सीएसएफ के लिए एक निष्पक्ष व्यापक प्रोटिओमिक्स दृष्टिकोण लागू किया, जो मस्तिष्क-आधारित पैथोफिजियोलॉजी की एक विस्तृत श्रृंखला को दर्शाता है। हमारे विश्लेषण ने पांच सीएसएफ बायोमार्कर पैनल तैयार किए, जो (i) सिनैप्स, रक्त वाहिकाओं, माइलिन, प्रतिरक्षा और चयापचय संबंधी शिथिलता को दर्शाते हैं; (ii) विभिन्न एमएस प्लेटफार्मों पर मजबूत प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्यता प्रदर्शित करना; (iii) एडी के प्रारंभिक और अंतिम चरणों में प्रगतिशील रोग-विशिष्ट परिवर्तन दिखाएं। कुल मिलाकर, ये निष्कर्ष एडी अनुसंधान और नैदानिक ​​​​अनुप्रयोगों के लिए विविध, विश्वसनीय, वेब-उन्मुख बायोमार्कर टूल के विकास की दिशा में एक आशाजनक कदम का प्रतिनिधित्व करते हैं।
हमारे परिणाम एडी मस्तिष्क नेटवर्क प्रोटिओम के अत्यधिक संरक्षित संगठन को प्रदर्शित करते हैं और सिस्टम-आधारित बायोमार्कर विकास के लिए एक एंकर के रूप में इसके उपयोग का समर्थन करते हैं। हमारे विश्लेषण से पता चलता है कि AD और AsymAD मस्तिष्क वाले दो स्वतंत्र TMT-MS डेटासेट में मजबूत मॉड्यूलरिटी है। ये निष्कर्ष हमारे पिछले काम का विस्तार करते हैं, जो ललाट, पार्श्विका और टेम्पोरल कॉर्टेक्स (17) में कई स्वतंत्र समूहों से 2,000 से अधिक मस्तिष्क ऊतकों के शक्तिशाली मॉड्यूल के संरक्षण का प्रदर्शन करते हैं। यह सर्वसम्मति नेटवर्क वर्तमान शोध में देखे गए विभिन्न रोग-संबंधी परिवर्तनों को दर्शाता है, जिसमें ग्लियाल-समृद्ध सूजन मॉड्यूल की वृद्धि और न्यूरॉन-समृद्ध मॉड्यूल की कमी शामिल है। वर्तमान शोध की तरह, यह बड़े पैमाने का नेटवर्क भी AsymAD में महत्वपूर्ण मॉड्यूलर परिवर्तन पेश करता है, जो विभिन्न प्रकार के प्रीक्लिनिकल पैथोफिजियोलॉजी (17) को दर्शाता है।
हालाँकि, इस अत्यधिक रूढ़िवादी प्रणाली-आधारित ढांचे के भीतर, विशेष रूप से AD के प्रारंभिक चरण में व्यक्तियों के बीच अधिक बारीक जैविक विविधता है। हमारा बायोमार्कर पैनल AsymAD में दो उपसमूहों को चित्रित करने में सक्षम है, जो कई सीएसएफ मार्करों की महत्वपूर्ण अंतर अभिव्यक्ति को प्रदर्शित करता है। हमारा समूह इन दो उपसमूहों के बीच जैविक अंतर को उजागर करने में सक्षम था, जो कोर एडी बायोमार्कर के स्तर पर स्पष्ट नहीं थे। नियंत्रण समूह की तुलना में, इन AsymAD व्यक्तियों का Aβ1-42/कुल ताऊ अनुपात असामान्य रूप से कम था। हालाँकि, केवल कुल टाउ स्तर दो AsymAD उपसमूहों के बीच काफी भिन्न थे, जबकि Aβ1-42 और p-tau स्तर अपेक्षाकृत तुलनीय रहे। चूँकि उच्च CSF ताऊ Aβ1-42 स्तरों (7) की तुलना में संज्ञानात्मक लक्षणों का बेहतर भविष्यवक्ता प्रतीत होता है, हमें संदेह है कि दोनों AsymAD समूहों में रोग के बढ़ने के अलग-अलग जोखिम हो सकते हैं। हमारे AsymAD के सीमित नमूना आकार और अनुदैर्ध्य डेटा की कमी को देखते हुए, इन निष्कर्षों को आत्मविश्वास से निकालने के लिए और अधिक शोध की आवश्यकता है। हालाँकि, इन परिणामों से संकेत मिलता है कि एक सिस्टम-आधारित सीएसएफ पैनल बीमारी के स्पर्शोन्मुख चरण के दौरान व्यक्तियों को प्रभावी ढंग से स्तरीकृत करने की हमारी क्षमता को बढ़ा सकता है।
कुल मिलाकर, हमारे निष्कर्ष AD के रोगजनन में कई जैविक कार्यों की भूमिका का समर्थन करते हैं। हालाँकि, अनियमित ऊर्जा चयापचय हमारे सभी पाँच मान्य लेबलिंग पैनलों का प्रमुख विषय बन गया। मेटाबोलिक प्रोटीन, जैसे कि हाइपोक्सैन्थिन-गुआनिन फॉस्फोरिबोसिलट्रांसफेरेज़ 1 (एचपीआरटी1) और लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज ए (एलडीएचए), सबसे मजबूत रूप से मान्य सिनैप्टिक बायोमार्कर हैं, जो दर्शाता है कि एडी सीएसएफ में वृद्धि अत्यधिक प्रजनन योग्य सेक्स है। हमारी रक्त वाहिकाओं और ग्लियाल पैनल में ऑक्सीडेटिव पदार्थों के चयापचय में शामिल कई मार्कर भी होते हैं। ये निष्कर्ष न केवल न्यूरॉन्स की उच्च ऊर्जा मांग को पूरा करने के लिए, बल्कि एस्ट्रोसाइट्स और अन्य ग्लियाल कोशिकाओं (17, 48) की उच्च ऊर्जा मांग को पूरा करने के लिए पूरे मस्तिष्क में चयापचय प्रक्रियाओं द्वारा निभाई जाने वाली महत्वपूर्ण भूमिका के अनुरूप हैं। हमारे परिणाम बढ़ते सबूतों का समर्थन करते हैं कि रेडॉक्स क्षमता में परिवर्तन और ऊर्जा मार्गों में रुकावट एडी के रोगजनन में शामिल कई प्रमुख प्रक्रियाओं के बीच मुख्य कड़ी हो सकती है, जिसमें माइटोकॉन्ड्रियल विकार, ग्लियाल-मध्यस्थ सूजन और संवहनी क्षति (49) शामिल हैं। इसके अलावा, मेटाबॉलिक सेरेब्रोस्पाइनल द्रव बायोमार्कर में हमारे नियंत्रण और AD-जैसे AsymAD उपसमूहों के बीच बड़ी संख्या में भिन्न रूप से समृद्ध प्रोटीन होते हैं, जो सुझाव देते हैं कि इन ऊर्जा और रेडॉक्स मार्गों का विघटन रोग के प्रीक्लिनिकल चरण में महत्वपूर्ण हो सकता है।
मस्तिष्क और मस्तिष्कमेरु द्रव पैनल के विभिन्न रुझान जो हमने देखे हैं उनमें दिलचस्प जैविक निहितार्थ भी हैं। न्यूरॉन्स से भरपूर सिनैप्स और मेटाबोलोम्स एडी मस्तिष्क में स्तर में कमी और मस्तिष्कमेरु द्रव में प्रचुर मात्रा में वृद्धि दर्शाते हैं। यह देखते हुए कि न्यूरॉन्स अपने कई विशिष्ट संकेतों (50) के लिए ऊर्जा प्रदान करने के लिए सिनैप्स पर ऊर्जा-उत्पादक माइटोकॉन्ड्रिया में समृद्ध हैं, इन दो न्यूरॉन समूहों की अभिव्यक्ति प्रोफाइल की समानता अपेक्षित है। न्यूरॉन्स की हानि और क्षतिग्रस्त कोशिकाओं के बाहर निकलने से बाद की बीमारी में मस्तिष्क और सीएसएफ पैनल के इन रुझानों की व्याख्या हो सकती है, लेकिन वे हमारे द्वारा देखे गए शुरुआती पैनल परिवर्तनों की व्याख्या नहीं कर सकते हैं (13)। प्रारंभिक स्पर्शोन्मुख बीमारी में इन निष्कर्षों के लिए एक संभावित स्पष्टीकरण असामान्य सिनैप्टिक प्रूनिंग है। माउस मॉडल में नए साक्ष्य से पता चलता है कि माइक्रोग्लिया-मध्यस्थ सिनैप्टिक फागोसाइटोसिस एडी में असामान्य रूप से सक्रिय हो सकता है और मस्तिष्क में प्रारंभिक सिनैप्स हानि का कारण बन सकता है (51)। यह छोड़ी गई सिनैप्टिक सामग्री सीएसएफ में जमा हो सकती है, यही कारण है कि हम न्यूरॉन पैनल में सीएसएफ में वृद्धि देखते हैं। प्रतिरक्षा-मध्यस्थ सिनैप्टिक प्रूनिंग आंशिक रूप से ग्लियाल प्रोटीन में वृद्धि की व्याख्या कर सकती है जो हम रोग प्रक्रिया के दौरान मस्तिष्क और मस्तिष्कमेरु द्रव में देखते हैं। सिनैप्टिक प्रूनिंग के अलावा, एक्सोसाइटिक मार्ग में समग्र असामान्यताएं भी न्यूरोनल मार्करों के विभिन्न मस्तिष्क और सीएसएफ अभिव्यक्तियों को जन्म दे सकती हैं। कई अध्ययनों से पता चला है कि एडी मस्तिष्क के रोगजनन में एक्सोसोम की सामग्री बदल गई है (52)। बाह्यकोशिकीय मार्ग Aβ (53, 54) के प्रसार में भी शामिल है। यह ध्यान देने योग्य है कि एक्सोसोमल स्राव का दमन एडी ट्रांसजेनिक माउस मॉडल (55) में एडी जैसी विकृति को कम कर सकता है।
उसी समय, संवहनी पैनल में प्रोटीन ने एडी मस्तिष्क में मध्यम वृद्धि देखी, लेकिन सीएसएफ में काफी कमी आई। रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) की शिथिलता इन निष्कर्षों को आंशिक रूप से समझा सकती है। कई स्वतंत्र पोस्टमॉर्टम मानव अध्ययनों ने AD (56, 57) में बीबीबी टूटने का प्रदर्शन किया है। इन अध्ययनों ने एंडोथेलियल कोशिकाओं की इस कसकर सील की गई परत के आसपास विभिन्न असामान्य गतिविधियों की पुष्टि की, जिसमें मस्तिष्क केशिका रिसाव और रक्त-जनित प्रोटीन का पेरिवास्कुलर संचय शामिल है (57)। यह मस्तिष्क में बढ़े हुए संवहनी प्रोटीन के लिए एक सरल स्पष्टीकरण प्रदान कर सकता है, लेकिन यह मस्तिष्कमेरु द्रव में इन्हीं प्रोटीनों की कमी को पूरी तरह से नहीं समझा सकता है। एक संभावना यह है कि केंद्रीय तंत्रिका तंत्र बढ़ती सूजन और ऑक्सीडेटिव तनाव की समस्या को हल करने के लिए इन अणुओं को सक्रिय रूप से अलग कर रहा है। इस पैनल में कुछ सबसे गंभीर सीएसएफ प्रोटीन में कमी, विशेष रूप से लिपोप्रोटीन विनियमन में शामिल, सूजन के हानिकारक स्तरों और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रक्रिया के निषेध से संबंधित है। यह पेरोक्सोनेज़ 1 (पीओएन1) के लिए सच है, एक लिपोप्रोटीन बाइंडिंग एंजाइम जो परिसंचरण में ऑक्सीडेटिव तनाव के स्तर को कम करने के लिए जिम्मेदार है (58, 59)। अल्फा-1-माइक्रोग्लोबुलिन/बिकुनिन प्रीकर्सर (एएमबीपी) संवहनी समूह का एक और महत्वपूर्ण रूप से डाउन-रेगुलेटेड मार्कर है। यह लिपिड ट्रांसपोर्टर बिकुनिन का अग्रदूत है, जो सूजन दमन और न्यूरोलॉजिकल सुरक्षा (60, 61) में भी शामिल है।
विभिन्न दिलचस्प परिकल्पनाओं के बावजूद, जैव रासायनिक रोग तंत्र का सीधे पता लगाने में असमर्थता खोज-संचालित प्रोटिओमिक्स विश्लेषण की एक प्रसिद्ध सीमा है। इसलिए, इन बायोमार्कर पैनलों के पीछे के तंत्र को आत्मविश्वास से परिभाषित करने के लिए और अधिक शोध आवश्यक है। एमएस-आधारित नैदानिक ​​​​विश्लेषण के विकास की दिशा में आगे बढ़ने के लिए, भविष्य की दिशा में बड़े पैमाने पर बायोमार्कर सत्यापन के लिए लक्षित मात्रात्मक तरीकों के उपयोग की भी आवश्यकता होती है, जैसे चयनात्मक या समानांतर प्रतिक्रिया निगरानी (62)। हमने हाल ही में यहां वर्णित कई सीएसएफ प्रोटीन परिवर्तनों को मान्य करने के लिए समानांतर प्रतिक्रिया निगरानी (63) का उपयोग किया है। YWHAZ, ALDOA और SMOC1 सहित कई प्राथमिकता पैनल लक्ष्यों को महत्वपूर्ण सटीकता के साथ निर्धारित किया गया है, जो क्रमशः हमारे सिनेप्स, चयापचय और सूजन पैनलों को मैप करते हैं (63)। स्वतंत्र डेटा अधिग्रहण (डीआईए) और अन्य एमएस-आधारित रणनीतियाँ भी लक्ष्य सत्यापन के लिए उपयोगी हो सकती हैं। बड एट अल. (64) हाल ही में यह प्रदर्शित किया गया था कि हमारे सीएसएफ खोज डेटा सेट और स्वतंत्र डीआईए-एमएस डेटा सेट में पहचाने गए एडी बायोमार्कर के बीच एक महत्वपूर्ण ओवरलैप है, जिसमें तीन अलग-अलग यूरोपीय समूहों से लगभग 200 सीएसएफ नमूने शामिल हैं। ये हालिया अध्ययन हमारे पैनलों को विश्वसनीय एमएस-आधारित पहचान में बदलने की क्षमता का समर्थन करते हैं। प्रमुख एडी बायोमार्कर के आगे के विकास के लिए पारंपरिक एंटीबॉडी और एप्टामर-आधारित पहचान भी महत्वपूर्ण है। सीएसएफ की कम प्रचुरता के कारण, उच्च-थ्रूपुट एमएस विधियों का उपयोग करके इन बायोमार्कर का पता लगाना अधिक कठिन है। एनईएफएल और एनआरजीएन कम-बहुतायत वाले सीएसएफ बायोमार्कर के दो ऐसे उदाहरण हैं, जिन्हें हमारे व्यापक विश्लेषण में पैनल में मैप किया गया है, लेकिन हमारी एकल एमएस रणनीति का उपयोग करके विश्वसनीय रूप से पता नहीं लगाया जा सकता है। पीईए जैसे कई एंटीबॉडी पर आधारित लक्ष्यीकरण रणनीतियाँ, इन मार्करों के नैदानिक ​​​​परिवर्तन को बढ़ावा दे सकती हैं।
कुल मिलाकर, यह अध्ययन विभिन्न प्रणालियों के आधार पर सीएसएफ एडी बायोमार्कर की पहचान और सत्यापन के लिए एक अद्वितीय प्रोटिओमिक्स दृष्टिकोण प्रदान करता है। अतिरिक्त एडी समूहों और एमएस प्लेटफार्मों में इन मार्कर पैनलों को अनुकूलित करना एडी जोखिम स्तरीकरण और उपचार को आगे बढ़ाने के लिए आशाजनक साबित हो सकता है। समय के साथ इन पैनलों के अनुदैर्ध्य स्तर का मूल्यांकन करने वाले अध्ययन यह निर्धारित करने के लिए भी महत्वपूर्ण हैं कि मार्करों का कौन सा संयोजन प्रारंभिक बीमारी के जोखिम और रोग की गंभीरता में बदलाव को सबसे अच्छा स्तरित करता है।
सीएसएफ द्वारा कॉपी किए गए 3 नमूनों को छोड़कर, इस अध्ययन में उपयोग किए गए सभी सीएसएफ नमूने एमोरी एडीआरसी या निकट संबंधी अनुसंधान संस्थानों के तत्वावधान में एकत्र किए गए थे। इन प्रोटिओमिक्स अध्ययनों में एमोरी सीएसएफ नमूनों के कुल चार सेटों का उपयोग किया गया था। सीएसएफ समूह में 20 स्वस्थ नियंत्रण और 20 एडी रोगियों के नमूने शामिल पाए गए। सीएसएफ कॉपी 1 में 32 स्वस्थ नियंत्रण, 31 एसिमएडी व्यक्तियों और 33 एडी व्यक्तियों के नमूने शामिल हैं। सीएसएफ कॉपी 2 में 147 नियंत्रण और 150 एडी नमूने हैं। बहु-रोग सीएसएफ प्रतिकृति 4 समूह में 18 नियंत्रण, 17 एडी, 19 एएलएस, 13 पीडी और 11 एफटीडी नमूने शामिल थे। एमोरी यूनिवर्सिटी इंस्टीट्यूशनल रिव्यू बोर्ड द्वारा अनुमोदित समझौते के अनुसार, सभी एमोरी अध्ययन प्रतिभागियों ने सूचित सहमति प्राप्त की। अल्जाइमर केंद्रों के लिए 2014 नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एजिंग बेस्ट प्रैक्टिस दिशानिर्देश (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html) के अनुसार, मस्तिष्कमेरु द्रव को काठ पंचर द्वारा एकत्र और संग्रहीत किया गया था। नियंत्रण और AsymAD और AD रोगियों को एमोरी कॉग्निटिव न्यूरोलॉजी क्लिनिक या गोइज़ुएटा ADRC में मानकीकृत संज्ञानात्मक मूल्यांकन प्राप्त हुआ। उनके मस्तिष्कमेरु द्रव के नमूनों का एलिसा Aβ1-42, कुल ताऊ और पी-ताउ विश्लेषण (65) के लिए INNO-BIA AlzBio3 Luminex द्वारा परीक्षण किया गया था। एलिसा मूल्यों का उपयोग स्थापित एडी बायोमार्कर कट-ऑफ मानदंड (66, 67) के आधार पर विषयों के नैदानिक ​​वर्गीकरण का समर्थन करने के लिए किया जाता है। अन्य सीएसएफ निदान (एफटीडी, एएलएस और पीडी) के लिए बुनियादी जनसांख्यिकीय और नैदानिक ​​डेटा भी एमोरी एडीआरसी या संबद्ध अनुसंधान संस्थानों से प्राप्त किया जाता है। इन एमोरी सीएसएफ मामलों का सारांश केस मेटाडेटा तालिका S1A में पाया जा सकता है। स्विस सीएसएफ प्रतिकृति 3 समूह की विशेषताएं पहले प्रकाशित की जा चुकी हैं (45)।
सीएसएफ को नमूना मिला. सीएसएफ डेटा सेट की हमारी खोज की गहराई को बढ़ाने के लिए, ट्रिप्सिनाइजेशन से पहले उच्च-प्रचुरता वाले प्रोटीन की प्रतिरक्षा खपत की गई थी। संक्षेप में, 40 व्यक्तिगत सीएसएफ नमूनों से 130 μl सीएसएफ और हाई सेलेक्ट टॉप14 एबंडेंस प्रोटीन डिप्लेशन रेजिन (थर्मो फिशर साइंटिफिक, ए36372) की एक समान मात्रा (130 μl) को कमरे में एक स्पिन कॉलम (थर्मो फिशर साइंटिफिक, ए89868) में रखा गया था। तापमान इनक्यूबेट)। 15 मिनट तक घुमाने के बाद, नमूने को 1000 ग्राम पर 2 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें। एक 3K अल्ट्रासेंट्रीफ्यूगल फिल्टर डिवाइस (मिलिपोर, UFC500396) का उपयोग 30 मिनट के लिए 14,000 ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करके अपशिष्ट नमूने को केंद्रित करने के लिए किया गया था। फॉस्फेट बफर्ड सलाइन के साथ सभी नमूना मात्राओं को 75 μl तक पतला करें। निर्माता के प्रोटोकॉल (थर्मो फिशर साइंटिफिक) के अनुसार प्रोटीन सांद्रता का मूल्यांकन बाइसीनकोनिक एसिड (बीसीए) विधि द्वारा किया गया था। सभी 40 नमूनों से इम्यूनोडिप्लेटेड सीएसएफ (60 μl) को लाइसिल एंडोपेप्टिडेज़ (एलवाईएससी) और ट्रिप्सिन के साथ पचाया गया था। संक्षेप में, नमूने को कम किया गया और 1.2 μl 0.5 M ट्राइस-2 (-कार्बोक्सीथाइल) -फॉस्फीन और 3 μl 0.8 M क्लोरोएसेटामाइड के साथ 90°C पर 10 मिनट के लिए एल्काइलेट किया गया, और फिर 15 मिनट के लिए पानी के स्नान में सोनिकेट किया गया। नमूना को 6 एम यूरिया की अंतिम सांद्रता तक 193 μl 8 एम यूरिया बफर [8 एम यूरिया और 100 मिमी NaHPO4 (पीएच 8.5)] के साथ पतला किया गया था। LysC (4.5 μg; वाको) का उपयोग कमरे के तापमान पर रात भर पाचन के लिए किया जाता है। फिर नमूने को 50 एमएम अमोनियम बाइकार्बोनेट (एबीसी) (68) के साथ 1 एम यूरिया में पतला किया गया। ट्रिप्सिन (पेमरेगा) की समान मात्रा (4.5 μg) जोड़ें, और फिर नमूने को 12 घंटे तक सेते रहें। पचे हुए पेप्टाइड घोल को 1% फॉर्मिक एसिड (एफए) और 0.1% ट्राइफ्लूरोएसेटिक एसिड (टीएफए) (66) की अंतिम सांद्रता तक अम्लीकृत करें, और फिर ऊपर वर्णित (25) के अनुसार 50 मिलीग्राम सेप-पाक सी18 कॉलम (वाटर्स) के साथ डीसॉल्ट करें। . फिर पेप्टाइड को 50% एसीटोनिट्राइल (एसीएन) के 1 मिलीलीटर में मिलाया गया। बैचों (25) में प्रोटीन मात्रा का मानकीकरण करने के लिए, सभी 40 सीएसएफ नमूनों से 100 μl एलिकोट्स को एक मिश्रित नमूना उत्पन्न करने के लिए जोड़ा गया था, जिसे बाद में पांच वैश्विक आंतरिक मानक (जीआईएस) (48) नमूनों में विभाजित किया गया था। सभी व्यक्तिगत नमूने और संयुक्त मानक हाई-स्पीड वैक्यूम (लैबकोनको) द्वारा सुखाए जाते हैं।
सीएसएफ नमूने की प्रतिलिपि बनाता है। डेयोन और सहकर्मियों ने पहले सीएसएफ कॉपी 3 नमूनों (45, 46) की प्रतिरक्षा कमी और पाचन का वर्णन किया है। शेष प्रतिकृति नमूने व्यक्तिगत रूप से प्रतिरक्षाविहीन नहीं थे। इन हटाए गए नमूनों को ट्रिप्सिन में पचाएं जैसा कि पहले बताया गया है (17)। प्रत्येक दोहराए गए विश्लेषण के लिए, प्रत्येक नमूने से एलुटेड पेप्टाइड के 120 μl एलिकोट्स को एक साथ एकत्र किया गया और टीएमटी-लेबल वाले वैश्विक आंतरिक मानक (48) के रूप में उपयोग करने के लिए समान मात्रा के एलिकोट्स में विभाजित किया गया। सभी व्यक्तिगत नमूने और संयुक्त मानक हाई-स्पीड वैक्यूम (लैबकोनको) द्वारा सुखाए जाते हैं। कम प्रचुरता वाले सीएसएफ प्रोटीन के संकेत को बढ़ाने के लिए, प्रत्येक नमूने से 125 μl को मिलाकर, प्रत्येक प्रतिकृति विश्लेषण के लिए एक "उन्नत" नमूना तैयार किया गया था [यानी, एक जैविक नमूना जो अनुसंधान नमूने की नकल करता है, लेकिन उपलब्ध मात्रा है बहुत बड़ा (37, 69)] मिश्रित सीएसएफ नमूने (17) में विलय हो गया। फिर मिश्रित नमूने को 12 मिलीलीटर हाई सेलेक्ट टॉप14 एबंडेंस प्रोटीन रिमूवल रेजिन (थर्मो फिशर साइंटिफिक, ए36372) का उपयोग करके प्रतिरक्षित किया गया, जैसा कि ऊपर वर्णित है, पचाया गया और बाद के मल्टीपल टीएमटी लेबलिंग में शामिल किया गया।