लेजर-गर्म सोने के नैनोकणों के साथ इन विट्रो में उच्च तापमान पर जीवन का अवलोकन किया गया

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थर्मोफाइल्स सूक्ष्मजीव हैं जो उच्च तापमान पर पनपते हैं। उनका अध्ययन करने से इस बारे में बहुमूल्य जानकारी मिल सकती है कि जीवन विषम परिस्थितियों में कैसे अनुकूल होता है। हालाँकि, पारंपरिक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के साथ उच्च तापमान की स्थिति प्राप्त करना मुश्किल है। स्थानीय प्रतिरोधक विद्युत तापन पर आधारित कई घरेलू समाधान प्रस्तावित किए गए हैं, लेकिन कोई सरल व्यावसायिक समाधान नहीं है। इस पेपर में, हम उपयोगकर्ता के वातावरण को हल्का रखते हुए थर्मोफाइल अध्ययन के लिए उच्च तापमान प्रदान करने के लिए माइक्रोस्कोप के दृश्य क्षेत्र पर सूक्ष्म लेजर हीटिंग की अवधारणा पेश करते हैं। बायोकंपैटिबल और कुशल प्रकाश अवशोषक के रूप में सोने के नैनोकण लेपित सब्सट्रेट का उपयोग करके मध्यम लेजर तीव्रता पर सूक्ष्म तापन प्राप्त किया जा सकता है। सूक्ष्म द्रव संवहन, कोशिका प्रतिधारण और केन्द्रापसारक थर्मोफोरेटिक गति के संभावित प्रभावों पर चर्चा की गई है। विधि को दो प्रजातियों में प्रदर्शित किया गया है: (i) जियोबैसिलस स्टीयरोथर्मोफिलस, एक सक्रिय थर्मोफिलिक जीवाणु जो लगभग 65 डिग्री सेल्सियस पर प्रजनन करता है, जिसे हमने सूक्ष्म ताप के तहत अंकुरित, विकसित और तैरते हुए देखा है; (ii) थियोबैसिलस एसपी, एक इष्टतम हाइपरथर्मोफिलिक आर्किया। 80°C पर. यह कार्य आधुनिक और किफायती माइक्रोस्कोपी उपकरणों का उपयोग करके थर्मोफिलिक सूक्ष्मजीवों के सरल और सुरक्षित अवलोकन का मार्ग प्रशस्त करता है।
अरबों वर्षों में, पृथ्वी पर जीवन पर्यावरणीय परिस्थितियों की एक विस्तृत श्रृंखला के अनुकूल विकसित हुआ है जिन्हें कभी-कभी हमारे मानवीय दृष्टिकोण से चरम माना जाता है। विशेष रूप से, कुछ थर्मोफिलिक सूक्ष्मजीव (बैक्टीरिया, आर्किया, कवक) जिन्हें थर्मोफाइल कहा जाता है, 45°C से 122°C1, 2, 3, 4 तक के तापमान में पनपते हैं। थर्मोफिलिक विभिन्न पारिस्थितिक तंत्रों में रहते हैं, जैसे गहरे समुद्र में हाइड्रोथर्मल वेंट, गर्म झरने या ज्वालामुखीय क्षेत्र. उनके शोध ने पिछले कुछ दशकों में कम से कम दो कारणों से काफी रुचि पैदा की है। सबसे पहले, हम उनसे सीख सकते हैं, उदाहरण के लिए, थर्मोफाइल 5, 6, एंजाइम 7, 8 और झिल्ली 9 इतने उच्च तापमान पर कैसे स्थिर होते हैं, या थर्मोफाइल विकिरण के चरम स्तर का सामना कैसे कर सकते हैं। दूसरा, वे कई महत्वपूर्ण जैव प्रौद्योगिकी अनुप्रयोगों1,11,12 का आधार हैं, जैसे ईंधन उत्पादन13,14,15,16, रासायनिक संश्लेषण (डायहाइड्रो, अल्कोहल, मीथेन, अमीनो एसिड, आदि)17, बायोमाइनिंग18 और थर्मोस्टेबल बायोकैटलिस्ट7,11, 13. विशेष रूप से, वर्तमान में प्रसिद्ध पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर)19 में थर्मोफिलिक जीवाणु थर्मस एक्वाटिकस से पृथक एक एंजाइम (टैक पोलीमरेज़) शामिल होता है, जो खोजे जाने वाले पहले थर्मोफाइल में से एक है।
हालाँकि, थर्मोफाइल्स का अध्ययन कोई आसान काम नहीं है और इसे किसी भी जैविक प्रयोगशाला में सुधारा नहीं जा सकता है। विशेष रूप से, जीवित थर्मोफाइल को किसी भी मानक प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ इन विट्रो में नहीं देखा जा सकता है, यहां तक ​​​​कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हीटिंग कक्षों के साथ भी, आमतौर पर 40 डिग्री सेल्सियस से कम तापमान के लिए रेट किया जाता है। 1990 के दशक के बाद से, केवल कुछ अनुसंधान समूहों ने उच्च तापमान माइक्रोस्कोपी (HTM) प्रणालियों की शुरूआत के लिए खुद को समर्पित किया है। 1994 में ग्लूख एट अल. हीटिंग/कूलिंग चैंबर की कल्पना पेल्टियर सेल के उपयोग के आधार पर की गई थी जो एनारोबिसिटी 20 को बनाए रखने के लिए बंद आयताकार केशिकाओं के तापमान को नियंत्रित करता है। डिवाइस को 2 डिग्री सेल्सियस/सेकेंड की दर से 100 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जा सकता है, जिससे लेखकों को हाइपरथर्मोफिलिक जीवाणु थर्मोटोगा मैरिटिमा21 की गतिशीलता का अध्ययन करने की अनुमति मिलती है। 1999 में हॉर्न एट अल. एक बहुत ही समान उपकरण विकसित किया गया है, जो अभी भी कोशिका विभाजन/कनेक्शन का अध्ययन करने के लिए वाणिज्यिक माइक्रोस्कोपी के लिए उपयुक्त गर्म केशिकाओं के उपयोग पर आधारित है। सापेक्ष निष्क्रियता की लंबी अवधि के बाद, प्रभावी एचटीएम की खोज 2012 में फिर से शुरू हुई, विशेष रूप से विर्थ समूह द्वारा कागजात की एक श्रृंखला के संबंध में जिसमें हॉर्न एट अल द्वारा आविष्कार किए गए उपकरण का उपयोग किया गया था। पंद्रह साल पहले, हाइपरथर्मोफाइल सहित बड़ी संख्या में आर्किया की गतिशीलता का अध्ययन गर्म केशिकाओं 23,24 का उपयोग करके 100 डिग्री सेल्सियस तक के तापमान पर किया गया था। उन्होंने तेजी से हीटिंग (निर्धारित तापमान तक पहुंचने के लिए 35 मिनट के बजाय कई मिनट) प्राप्त करने और पूरे माध्यम में 2 सेमी से अधिक की रैखिक तापमान ढाल प्राप्त करने के लिए मूल माइक्रोस्कोप को भी संशोधित किया। इस तापमान ग्रेडिएंट शेपिंग डिवाइस (टीजीएफडी) का उपयोग जैविक रूप से प्रासंगिक दूरी 24, 25 पर तापमान ग्रेडिएंट के भीतर कई थर्मोफाइल की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए किया गया है।
बंद केशिकाओं को गर्म करना जीवित थर्मोफाइल्स का निरीक्षण करने का एकमात्र तरीका नहीं है। 2012 में, कुवाबारा एट अल। गर्मी प्रतिरोधी चिपकने वाले (सुपर एक्स2; सेमेडिन, जापान) से सील किए गए घर में बने डिस्पोजेबल पाइरेक्स चैंबर का उपयोग किया गया। नमूनों को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पारदर्शी हीटिंग प्लेट (माइक्रो हीट प्लेट, किताज़ातो कॉर्पोरेशन, जापान) पर रखा गया था जो 110 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करने में सक्षम थी, लेकिन मूल रूप से बायोइमेजिंग के लिए नहीं थी। लेखकों ने 65°C पर अवायवीय थर्मोफिलिक बैक्टीरिया (थर्मोसिफो ग्लोबिफॉर्मन्स, दोगुना होने का समय 24 मिनट) का कुशल विभाजन देखा। 2020 में, पुल्शेन एट अल। व्यावसायिक धातु के बर्तनों (एटोफ्लोरोटीएम, थर्मोफिशर) के कुशल तापन को दो घरेलू ताप तत्वों का उपयोग करके प्रदर्शित किया गया: एक ढक्कन और एक चरण (पीसीआर मशीन-प्रेरित कॉन्फ़िगरेशन)। इस जुड़ाव के परिणामस्वरूप एक समान तरल तापमान होता है और ढक्कन के नीचे वाष्पीकरण और संघनन को रोकता है। ओ-रिंग का उपयोग पर्यावरण के साथ गैस विनिमय से बचाता है। इस HTM, जिसे सल्फ़ोस्कोप कहा जाता है, का उपयोग 75°C27 पर सल्फ़ोलोबस एसिडोकैल्डेरियस की छवि के लिए किया गया था।
इन सभी प्रणालियों की एक मान्यता प्राप्त सीमा वायु उद्देश्यों के उपयोग पर प्रतिबंध थी, किसी भी तेल का विसर्जन इतने उच्च तापमान के लिए अनुपयुक्त था और > 1-मिमी मोटे पारदर्शी नमूनों के माध्यम से इमेजिंग के लिए। इन सभी प्रणालियों की एक मान्यता प्राप्त सीमा वायु उद्देश्यों के उपयोग पर प्रतिबंध थी, किसी भी तेल का विसर्जन इतने उच्च तापमान के लिए अनुपयुक्त था और > 1-मिमी मोटे पारदर्शी नमूनों के माध्यम से इमेजिंग के लिए। Общепризнанным недостатком вэх этих стих сис с сы ही ны ही на на на нползование воъзшшшXоF пзPзPзVзVOSSк пзPзPзVзROMPых пюPзPз пюPзPых пюPз пюPыхPых пюPыхRеROM</s>VORMрRзVO भी нное погружение м масло не подходило для такой ыысокок температуры и иля дззл птбц птPзMбц птPзц птPзц птPзц птбRзц птбRзц птбRзц птбRзз птбRз птб птб птб птб птб птб птб птб птб птб пт п ही इन सभी प्रणालियों की एक पहचानी गई कमी वायु उद्देश्यों के उपयोग की सीमा थी, क्योंकि कोई भी तेल विसर्जन इतने उच्च तापमान और 1 मिमी से अधिक मोटे पारदर्शी नमूनों के माध्यम से दृश्य के लिए उपयुक्त नहीं था।所有这些系统的一个公认限制是限制使用空气物镜,任何油浸都不适合这样的高温和通过> 1 मेरे लिए यह एक अच्छा विचार है। इन सभी प्रणालियों की एक मान्यता प्राप्त सीमा वायु-प्रवेशित दर्पण का उपयोग करने की सीमा है, क्योंकि कोई भी तेल विसर्जन ऐसे उच्च तापमान पर 1 मिमी से अधिक मोटे पारदर्शी नमूनों की इमेजिंग के लिए अनुपयुक्त है। Общепризнанным недостатком вэх этих стих систем पतृचन яв ही ружение в масло непригодно для таких ыысоких температур и визуализации черер пчрзXз тPычXы> 1 इन सभी प्रणालियों का एक पहचाना हुआ दोष एयर लेंस का सीमित उपयोग है, कोई भी तेल विसर्जन इतने उच्च तापमान और 1 मिमी से अधिक मोटे पारदर्शी नमूनों के माध्यम से दृश्य के लिए अनुपयुक्त है।अभी हाल ही में, चार्ल्स-ऑरज़ैग एट अल द्वारा इस सीमा को हटा दिया गया था। 28, जिन्होंने एक ऐसा उपकरण विकसित किया जो अब रुचि की प्रणाली के चारों ओर गर्मी प्रदान नहीं करता है, बल्कि कवर ग्लास के अंदर ही, आईटीओ (इंडियम-टिन ऑक्साइड) से बने प्रतिरोधी की एक पतली पारदर्शी परत से ढका हुआ है। पारदर्शी परत के माध्यम से विद्युत धारा प्रवाहित करके ढक्कन को 75 डिग्री सेल्सियस तक गर्म किया जा सकता है। हालाँकि, लेखक को लेंस को उद्देश्य तक गर्म करना चाहिए, लेकिन 65 डिग्री सेल्सियस से अधिक नहीं, ताकि इसे नुकसान न पहुंचे।
इन कार्यों से पता चलता है कि कुशल उच्च तापमान ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के विकास को व्यापक रूप से नहीं अपनाया गया है, इसके लिए अक्सर घरेलू उपकरणों की आवश्यकता होती है, और इसे अक्सर स्थानिक रिज़ॉल्यूशन की कीमत पर हासिल किया जाता है, जो एक गंभीर नुकसान है क्योंकि थर्मोफिलिक सूक्ष्मजीव कुछ से बड़े नहीं होते हैं माइक्रोमीटर. कम हीटिंग वॉल्यूम एचटीएम की तीन अंतर्निहित समस्याओं को हल करने की कुंजी है: खराब स्थानिक रिज़ॉल्यूशन, सिस्टम गर्म होने पर उच्च तापीय जड़ता, और अत्यधिक तापमान पर आसपास के तत्वों (विसर्जन तेल, ऑब्जेक्टिव लेंस ... या उपयोगकर्ता के हाथ) का हानिकारक हीटिंग। ).
इस पेपर में, हम थर्मोफाइल अवलोकन के लिए एक एचटीएम पेश करते हैं जो प्रतिरोधी हीटिंग पर आधारित नहीं है। इसके बजाय, हमने प्रकाश-अवशोषित सब्सट्रेट के लेजर विकिरण द्वारा माइक्रोस्कोप के दृश्य क्षेत्र के एक सीमित क्षेत्र के भीतर स्थानीयकृत हीटिंग हासिल किया। मात्रात्मक चरण माइक्रोस्कोपी (क्यूपीएम) का उपयोग करके तापमान वितरण की कल्पना की गई थी। इस विधि की प्रभावशीलता जियोबैसिलस स्टीयरोथर्मोफिलस द्वारा प्रदर्शित की जाती है, जो एक गतिशील थर्मोफिलिक जीवाणु है जो लगभग 65°C पर प्रजनन करता है और इसका दोगुना समय (लगभग 20 मिनट) होता है, और सल्फोलोबस शिबाटे, एक हाइपरथर्मोफाइल जो 80°C (आर्किया) पर इष्टतम रूप से बढ़ता है। उदाहरण देकर स्पष्ट करने के लिए। सामान्य प्रतिकृति दर और तैराकी को तापमान के आधार पर देखा गया। यह लेज़र HTM (LA-HTM) कवरस्लिप की मोटाई या उद्देश्य की प्रकृति (वायु या तेल विसर्जन) द्वारा सीमित नहीं है। यह बाज़ार में उपलब्ध किसी भी उच्च रिज़ॉल्यूशन लेंस का उपयोग करने की अनुमति देता है। यह तापीय जड़ता के कारण धीमी गति से गर्म होने से भी प्रभावित नहीं होता है (मिलीसेकंड पैमाने पर तुरंत हीटिंग प्राप्त करता है) और केवल व्यावसायिक रूप से उपलब्ध घटकों का उपयोग करता है। एकमात्र नई सुरक्षा चिंताएं डिवाइस के अंदर और संभवतः आंखों के माध्यम से शक्तिशाली लेजर बीम (आमतौर पर 100 मेगावाट तक) की उपस्थिति से संबंधित हैं, जिसके लिए सुरक्षात्मक चश्मे की आवश्यकता होती है।
एलए-एचटीएम का सिद्धांत माइक्रोस्कोप के दृश्य क्षेत्र के भीतर नमूने को स्थानीय रूप से गर्म करने के लिए लेजर का उपयोग करना है (चित्र 1 ए)। ऐसा करने के लिए, नमूना प्रकाश-अवशोषित होना चाहिए। उचित लेजर शक्ति (100 मेगावाट से कम) का उपयोग करने के लिए, हमने तरल माध्यम द्वारा प्रकाश के अवशोषण पर भरोसा नहीं किया, बल्कि सब्सट्रेट को सोने के नैनोकणों (छवि 1 सी) के साथ कोटिंग करके नमूने के अवशोषण को कृत्रिम रूप से बढ़ाया। बायोमेडिसिन, नैनोकैमिस्ट्री या सूरज की रोशनी की कटाई में अपेक्षित अनुप्रयोगों के साथ, थर्मल प्लास्मोनिक्स के क्षेत्र में सोने के नैनोकणों को प्रकाश के साथ गर्म करना मौलिक महत्व है। पिछले कुछ वर्षों में, हमने भौतिकी, रसायन विज्ञान और जीव विज्ञान में थर्मल प्लाज्मा अनुप्रयोगों से संबंधित कई अध्ययनों में इस एलए-एचटीएम का उपयोग किया है। इस विधि में मुख्य कठिनाई अंतिम तापमान प्रोफ़ाइल प्रदर्शित करने में है, क्योंकि ऊंचा तापमान नमूने के भीतर एक सूक्ष्म क्षेत्र तक सीमित है। हमने दिखाया है कि तापमान मानचित्रण चार-तरंग दैर्ध्य अनुप्रस्थ कतरनी इंटरफेरोमीटर के साथ प्राप्त किया जा सकता है, जो दो-आयामी विवर्तन झंझरी (जिसे क्रॉस झंझरी के रूप में भी जाना जाता है) के उपयोग के आधार पर मात्रात्मक चरण माइक्रोस्कोपी की एक सरल, उच्च-रिज़ॉल्यूशन और बहुत संवेदनशील विधि है। 33,34,35,36. क्रॉस ग्रेटिंग वेवफ्रंट माइक्रोस्कोपी (सीजीएम) पर आधारित इस थर्मल माइक्रोस्कोपी तकनीक की विश्वसनीयता पिछले दशक में प्रकाशित एक दर्जन पत्रों में प्रदर्शित की गई है37,38,39,40,41,42,43।
समानांतर लेजर हीटिंग, आकार देने और तापमान माइक्रोस्कोप की स्थापना की योजना। बी नमूना ज्यामिति जिसमें एक एटोफ्लोरोटीएम कक्ष होता है जिसमें सोने के नैनोकणों से लेपित कवरस्लिप होता है। c नमूने को ध्यान से देखें (पैमाने के अनुसार नहीं)। डी एक समान लेजर बीम प्रोफाइल और (ई) सोने के नैनोकणों के नमूना विमान पर अनुरूपित बाद के तापमान वितरण का प्रतिनिधित्व करता है। एफ एक कुंडलाकार लेजर बीम प्रोफ़ाइल है जो एक समान तापमान उत्पन्न करने के लिए उपयुक्त है जैसा कि (जी) में दिखाए गए परिणामी तापमान वितरण के सिमुलेशन में दिखाया गया है। स्केल बार: 30 µm.
विशेष रूप से, हमने हाल ही में एलए-एचटीएम और सीजीएम के साथ स्तनधारी कोशिकाओं का ताप हासिल किया है और 37-42 डिग्री सेल्सियस की सीमा में सेलुलर हीट शॉक प्रतिक्रियाओं को ट्रैक किया है, जो एकल जीवित कोशिका इमेजिंग के लिए इस तकनीक की प्रयोज्यता को प्रदर्शित करता है। हालाँकि, उच्च तापमान पर सूक्ष्मजीवों के अध्ययन के लिए LA-HTM का अनुप्रयोग स्पष्ट नहीं है, क्योंकि इसमें स्तनधारी कोशिकाओं की तुलना में अधिक सावधानी की आवश्यकता होती है: सबसे पहले, माध्यम के तल को दसियों डिग्री (कुछ डिग्री के बजाय) तक गर्म करने से परिणाम मिलता है एक मजबूत ऊर्ध्वाधर तापमान ढाल के लिए। द्रव संवहन 44 बना सकता है, जो यदि सब्सट्रेट से मजबूती से जुड़ा नहीं है, तो बैक्टीरिया के अवांछनीय आंदोलन और मिश्रण का कारण बन सकता है। तरल परत की मोटाई को कम करके इस संवहन को समाप्त किया जा सकता है। इस प्रयोजन के लिए, नीचे प्रस्तुत सभी प्रयोगों में, बैक्टीरियल सस्पेंशन को धातु के कप (एटोफ्लोरटीएम, थर्मोफिशर, चित्र 1 बी, सी) के अंदर रखे गए लगभग 15 माइक्रोन मोटे दो कवरस्लिप्स के बीच रखा गया था। सिद्धांत रूप में, यदि तरल की मोटाई हीटिंग लेजर के बीम आकार से छोटी है तो संवहन से बचा जा सकता है। दूसरे, ऐसी सीमित ज्यामिति में काम करने से एरोबिक जीवों का दम घुट सकता है (चित्र S2 देखें)। ऑक्सीजन (या किसी अन्य महत्वपूर्ण गैस) के लिए पारगम्य सब्सट्रेट का उपयोग करके, कवरस्लिप के अंदर फंसे हुए हवा के बुलबुले को छोड़कर, या शीर्ष कवरस्लिप में छेद करके इस समस्या से बचा जा सकता है (चित्र S1 देखें) 45। इस अध्ययन में, हमने बाद वाला समाधान चुना (चित्र 1बी और एस1)। अंत में, लेजर हीटिंग एक समान तापमान वितरण प्रदान नहीं करता है। लेजर बीम की समान तीव्रता (छवि 1 डी) पर भी, तापमान वितरण एक समान नहीं है, बल्कि थर्मल प्रसार (छवि 1 ई) के कारण गाऊसी वितरण जैसा दिखता है। जब लक्ष्य जैविक प्रणालियों के अध्ययन के लिए दृश्य क्षेत्र में सटीक तापमान स्थापित करना है, तो असमान प्रोफाइल आदर्श नहीं हैं और यदि वे सब्सट्रेट का पालन नहीं करते हैं तो बैक्टीरिया के थर्मोफोरेटिक आंदोलन को भी जन्म दे सकते हैं (चित्र S3, S4 देखें)39। इस प्रयोजन के लिए, हमने किसी दिए गए ज्यामितीय क्षेत्र के भीतर एक बिल्कुल समान तापमान वितरण प्राप्त करने के लिए नमूने के विमान में रिंग के आकार (छवि 1 एफ) के अनुसार अवरक्त लेजर बीम को आकार देने के लिए एक स्थानिक प्रकाश मॉड्यूलेटर (एसएलएम) का उपयोग किया। थर्मल प्रसार के बावजूद (चित्र 1डी) 39, 42, 46। माध्यम के वाष्पीकरण से बचने और कम से कम कुछ दिनों तक निरीक्षण करने के लिए एक धातु डिश (चित्र 1 बी) पर एक शीर्ष कवरस्लिप रखें। चूँकि यह शीर्ष कवरस्लिप सील नहीं है, यदि आवश्यक हो तो किसी भी समय अतिरिक्त माध्यम आसानी से जोड़ा जा सकता है।
यह समझाने के लिए कि एलए-एचटीएम कैसे काम करता है और थर्मोफिलिक अनुसंधान में इसकी प्रयोज्यता प्रदर्शित करता है, हमने एरोबिक बैक्टीरिया जियोबैसिलस स्टीयरोथर्मोफिलस का अध्ययन किया, जिसका इष्टतम विकास तापमान लगभग 60-65 डिग्री सेल्सियस है। जीवाणु में फ्लैगेला और तैरने की क्षमता भी होती है, जो सामान्य सेलुलर गतिविधि का एक और संकेतक प्रदान करती है।
नमूने (छवि 1 बी) को एक घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व-ऊष्मायन किया गया और फिर एलए-एचटीएम नमूना धारक में रखा गया। यह प्री-इन्क्यूबेशन वैकल्पिक है, लेकिन दो कारणों से अभी भी उपयोगी है: पहला, जब लेजर चालू होता है, तो यह कोशिकाओं को तुरंत बढ़ने और विभाजित करने का कारण बनता है (पूरक सामग्री में मूवी एम 1 देखें)। पूर्व-ऊष्मायन के बिना, हर बार नमूने पर एक नया देखने का क्षेत्र गर्म करने पर बैक्टीरिया के विकास में लगभग 40 मिनट की देरी होती है। दूसरा, 1 घंटे पूर्व-ऊष्मायन ने कवरस्लिप में बैक्टीरिया के आसंजन को बढ़ावा दिया, जिससे लेजर चालू होने पर थर्मोफोरेसिस के कारण कोशिकाओं को दृश्य क्षेत्र से बाहर जाने से रोका गया (पूरक सामग्री में फिल्म एम 2 देखें)। थर्मोफोरेसिस एक तापमान प्रवणता के साथ कणों या अणुओं की गति है, आमतौर पर गर्म से ठंडे की ओर, और बैक्टीरिया कोई अपवाद नहीं हैं43,47। लेजर बीम को आकार देने और एक सपाट तापमान वितरण प्राप्त करने के लिए एसएलएम का उपयोग करके किसी दिए गए क्षेत्र पर इस अवांछनीय प्रभाव को समाप्त किया जाता है।
अंजीर पर. चित्र 2 एक कुंडलाकार लेजर बीम (छवि 1 एफ) के साथ सोने के नैनोकणों से लेपित ग्लास सब्सट्रेट को विकिरणित करके प्राप्त सीजीएम द्वारा मापा गया तापमान वितरण दिखाता है। लेजर बीम द्वारा कवर किए गए पूरे क्षेत्र में एक सपाट तापमान वितरण देखा गया। इस क्षेत्र को 65°C पर सेट किया गया था, जो इष्टतम विकास तापमान है। इस क्षेत्र के बाहर, तापमान वक्र स्वाभाविक रूप से \(1/r\) तक गिर जाता है (जहां \(r\) रेडियल समन्वय है)।
एक गोलाकार क्षेत्र पर एक सपाट तापमान प्रोफ़ाइल प्राप्त करने के लिए सोने के नैनोकणों की एक परत को विकिरणित करने के लिए एक कुंडलाकार लेजर बीम का उपयोग करके प्राप्त सीजीएम माप का तापमान मानचित्र। बी तापमान मानचित्र का इज़ोटेर्म (ए)। लेज़र बीम का समोच्च एक ग्रे बिंदीदार वृत्त द्वारा दर्शाया गया है। प्रयोग दो बार दोहराया गया (पूरक सामग्री देखें, चित्र S4)।
LA-HTM का उपयोग करके कई घंटों तक जीवाणु कोशिकाओं की व्यवहार्यता की निगरानी की गई। अंजीर पर. 3 3 घंटे 20 मिनट की मूवी (मूवी एम 3, अनुपूरक सूचना) से ली गई चार छवियों के लिए समय अंतराल दिखाता है। लेज़र द्वारा परिभाषित वृत्ताकार क्षेत्र के भीतर बैक्टीरिया को सक्रिय रूप से पनपते देखा गया जहाँ तापमान इष्टतम था, जो 65 डिग्री सेल्सियस के करीब था। इसके विपरीत, जब तापमान 10 सेकंड के लिए 50 डिग्री सेल्सियस से नीचे चला गया तो कोशिका वृद्धि काफी कम हो गई।
अलग-अलग समय पर लेजर हीटिंग के बाद बढ़ने वाले जी. स्टीयरोथर्मोफिलस बैक्टीरिया की ऑप्टिकल गहराई वाली छवियां, (ए) टी = 0 मिनट, (बी) 1 घंटे 10 मिनट, (सी) 2 घंटे 20 मिनट, (डी) 3 घंटे 20 मिनट, बाहर 200 एक मिनट की फिल्म (पूरक सूचना में प्रदान की गई एम3 फिल्म) से निकाला गया जो संबंधित तापमान मानचित्र पर लगाया गया है। लेज़र \(t=0\) समय पर चालू होता है। तीव्रता छवि में इज़ोटेर्म जोड़े गए हैं।
कोशिका वृद्धि और तापमान पर इसकी निर्भरता को और अधिक निर्धारित करने के लिए, हमने मूवी एम3 दृश्य क्षेत्र में प्रारंभिक रूप से पृथक बैक्टीरिया की विभिन्न कॉलोनियों के बायोमास में वृद्धि को मापा (चित्र 4)। मिनी कॉलोनी बनाने वाली इकाई (एमसीएफयू) के गठन की शुरुआत में चुने गए मूल बैक्टीरिया को चित्र S6 में दिखाया गया है। शुष्क द्रव्यमान का माप सीजीएम 48 कैमरे से लिया गया जिसका उपयोग तापमान वितरण को मैप करने के लिए किया गया था। शुष्क वजन और तापमान को मापने के लिए सीजीएम की क्षमता एलए-एचटीएम की ताकत है। जैसा कि अपेक्षित था, उच्च तापमान के कारण जीवाणुओं का विकास तेजी से हुआ (चित्र 4ए)। जैसा कि चित्र 4बी में सेमी-लॉग प्लॉट में दिखाया गया है, सभी तापमानों पर वृद्धि घातीय वृद्धि के बाद होती है, जहां डेटा घातीय फ़ंक्शन \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ का उपयोग करता है) {{ \mbox{cst}}}\), जहां \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}2\) - पीढ़ी का समय (या दोगुना होने का समय), \( g =1/ \tau\) - विकास दर (प्रति इकाई समय में डिवीजनों की संख्या)। अंजीर पर. 4सी तापमान के फलन के रूप में संबंधित विकास दर और उत्पादन समय को दर्शाता है। तेजी से बढ़ने वाले एमसीएफयू की विशेषता दो घंटों के बाद विकास की संतृप्ति है, जो उच्च जीवाणु घनत्व (शास्त्रीय तरल संस्कृतियों में स्थिर चरण के समान) के कारण अपेक्षित व्यवहार है। सामान्य आकार \(g\left(T\right)\) (चित्र 4c) 60-65°C के आसपास इष्टतम विकास दर के साथ G. स्टीयरोथर्मोफिलस के लिए अपेक्षित दो-चरण वक्र से मेल खाता है। कार्डिनल मॉडल (चित्र S5)49 का उपयोग करके डेटा का मिलान करें जहां \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt}} ;{T}_{{\max}}\right)\) = (0.70 ± 0.2; 40 ± 4; 65 ± 1.6; 67 ± 3) डिग्री सेल्सियस, जो साहित्य49 में उद्धृत अन्य मूल्यों से अच्छी तरह मेल खाता है। यद्यपि तापमान पर निर्भर पैरामीटर प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं, \({G}_{0}\) की अधिकतम वृद्धि दर एक प्रयोग से दूसरे प्रयोग में भिन्न हो सकती है (आंकड़े S7-S9 और मूवी M4 देखें)। तापमान फिटिंग मापदंडों के विपरीत, जो सार्वभौमिक होना चाहिए, अधिकतम वृद्धि दर प्रेक्षित सूक्ष्म ज्यामिति के भीतर माध्यम के गुणों (पोषक तत्वों की उपलब्धता, ऑक्सीजन एकाग्रता) पर निर्भर करती है।
विभिन्न तापमानों पर माइक्रोबियल वृद्धि। mCFU: लघु कॉलोनी बनाने वाली इकाइयाँ। तापमान प्रवणता (मूवी एम3) में बढ़ते एक एकल जीवाणु के वीडियो से प्राप्त डेटा। बी (ए), अर्ध-लघुगणकीय पैमाने के समान। सी विकास दर\(\tau\) और पीढ़ी समय\(g\) की गणना रैखिक प्रतिगमन (बी) से की जाती है। क्षैतिज त्रुटि पट्टियाँ: तापमान सीमा जिस पर विकास के दौरान mCFUs का दृश्य क्षेत्र में विस्तार हुआ। लंबवत त्रुटि पट्टियाँ: रैखिक प्रतिगमन मानक त्रुटि।
सामान्य वृद्धि के अलावा, कुछ बैक्टीरिया कभी-कभी लेजर हीटिंग के दौरान दृश्य में तैरने लगते हैं, जो कि फ्लैगेल्ला वाले बैक्टीरिया के लिए एक अपेक्षित व्यवहार है। अतिरिक्त जानकारी में फिल्म एम5 ऐसी तैराकी गतिविधियों को दिखाती है। इस प्रयोग में, तापमान प्रवणता बनाने के लिए समान लेजर विकिरण का उपयोग किया गया था, जैसा कि चित्र 1d, e और S3 में दिखाया गया है। चित्र 5 एम5 मूवी से चुने गए दो छवि अनुक्रम दिखाता है जिसमें दिखाया गया है कि एक जीवाणु दिशात्मक गति प्रदर्शित करता है जबकि अन्य सभी जीवाणु गतिहीन रहते हैं।
दो समय-सीमाएँ (ए) और (बी) बिंदीदार वृत्तों से चिह्नित दो अलग-अलग जीवाणुओं की तैराकी को दर्शाती हैं। छवियाँ M5 मूवी (पूरक सामग्री के रूप में प्रदान की गई) से निकाली गई थीं।
जी. स्टीयरोथर्मोफिलस के मामले में, बैक्टीरिया की सक्रिय गति लेजर बीम चालू होने के कुछ सेकंड बाद शुरू हुई (चित्र 5)। यह अवलोकन तापमान में वृद्धि के प्रति इस थर्मोफिलिक सूक्ष्मजीव की अस्थायी प्रतिक्रिया पर जोर देता है, जैसा कि मोरा एट अल द्वारा पहले ही देखा जा चुका है। 24 . एलए-एचटीएम का उपयोग करके जीवाणु गतिशीलता और यहां तक ​​कि थर्मोटैक्सिस के विषय को और अधिक खोजा जा सकता है।
माइक्रोबियल तैराकी को अन्य प्रकार की भौतिक गति के साथ भ्रमित नहीं किया जाना चाहिए, अर्थात् (i) ब्राउनियन गति, जो बिना किसी निश्चित दिशा के अराजक गति प्रतीत होती है, (ii) संवहन 50 और थर्मोफोरेसिस 43, जिसमें तापमान के साथ गति का नियमित बहाव शामिल है ढाल.
जी. स्टीयरोथर्मोफिलस को बचाव के रूप में प्रतिकूल पर्यावरणीय परिस्थितियों के संपर्क में आने पर अत्यधिक प्रतिरोधी बीजाणु (बीजाणु गठन) उत्पन्न करने की क्षमता के लिए जाना जाता है। जब पर्यावरणीय परिस्थितियाँ फिर से अनुकूल हो जाती हैं, तो बीजाणु अंकुरित होते हैं, जीवित कोशिकाएँ बनाते हैं और विकास फिर से शुरू करते हैं। हालाँकि यह स्पोरुलेशन/अंकुरण प्रक्रिया सर्वविदित है, लेकिन इसे वास्तविक समय में कभी नहीं देखा गया है। एलए-एचटीएम का उपयोग करते हुए, हम यहां जी. स्टीयरोथर्मोफिलस में अंकुरण घटनाओं के पहले अवलोकन की रिपोर्ट करते हैं।
अंजीर पर. 6ए 13 बीजाणुओं के सीजीएम सेट का उपयोग करके प्राप्त ऑप्टिकल गहराई (ओटी) की समय-चूक छवियां दिखाता है। पूरे संग्रह समय के लिए (15 घंटे 6 मिनट, \(t=0\) - लेज़र हीटिंग की शुरुआत), 13 में से 4 बीजाणु, क्रमिक समय बिंदुओं पर \(t=2\) घंटे, \( 3\) अंकुरित हुए ) h \(10 \)', \(9\) h \(40\)' और \(11\) h \(30\)'। हालाँकि इनमें से केवल एक घटना को चित्र 6 में दिखाया गया है, पूरक सामग्री में M6 फिल्म में 4 अंकुरण घटनाओं को देखा जा सकता है। दिलचस्प बात यह है कि अंकुरण यादृच्छिक प्रतीत होता है: पर्यावरणीय परिस्थितियों में समान परिवर्तन के बावजूद, सभी बीजाणु एक ही समय में अंकुरित नहीं होते हैं और न ही अंकुरित होते हैं।
एक टाइम-लैप्स जिसमें 8 ओटी छवियां (तेल विसर्जन, 60x, 1.25 एनए उद्देश्य) और (बी) जी. स्टीयरोथर्मोफिलस समुच्चय का बायोमास विकास शामिल है। सी (बी) विकास दर (धराशायी रेखा) की रैखिकता को उजागर करने के लिए अर्ध-लॉग पैमाने पर खींचा गया।
अंजीर पर. 6बी,सी डेटा संग्रह की पूरी अवधि के दौरान समय के एक कार्य के रूप में दृश्य क्षेत्र में सेल आबादी के बायोमास को दर्शाता है। अंजीर में \(t=5\)h पर शुष्क द्रव्यमान का तीव्र क्षय देखा गया। 6बी, सी, दृश्य क्षेत्र से कुछ कोशिकाओं के बाहर निकलने के कारण। इन चार घटनाओं की वृद्धि दर \(0.77\pm 0.1\) h-1 है। यह मान चित्र 3.3 और 4 से जुड़ी वृद्धि दर से अधिक है, जहां कोशिकाएं सामान्य रूप से बढ़ती हैं। बीजाणुओं से जी. स्टीयरोथर्मोफिलस की वृद्धि दर में वृद्धि का कारण स्पष्ट नहीं है, लेकिन ये माप एलए-एचटीएम की रुचि को उजागर करते हैं और कोशिका जीवन की गतिशीलता के बारे में अधिक जानने के लिए एकल कोशिका स्तर (या एकल एमसीएफयू स्तर पर) पर काम करते हैं। .
एलए-एचटीएम की बहुमुखी प्रतिभा और उच्च तापमान पर इसके प्रदर्शन को प्रदर्शित करने के लिए, हमने 80°C51 के इष्टतम विकास तापमान के साथ एक हाइपरथर्मोफिलिक एसिडोफिलिक आर्किया, सल्फ़ोलोबस शिबाटे की वृद्धि की जांच की। जी. स्टीयरोथर्मोफिलस की तुलना में, इन आर्किया की आकृति विज्ञान भी बहुत अलग है, जो लम्बी छड़ों (बेसिली) के बजाय 1 माइक्रोन गोले (कोक्सी) जैसा दिखता है।
चित्र 7ए में सीजीएम का उपयोग करके प्राप्त एस. शिबाटे एमसीएफयू की अनुक्रमिक ऑप्टिकल गहराई वाली छवियां शामिल हैं (पूरक सामग्री में एम7 फीचर फिल्म देखें)। यह mCFU लगभग 73°C पर बढ़ता है, जो कि 80°C के इष्टतम तापमान से कम है, लेकिन सक्रिय विकास के लिए तापमान सीमा के भीतर है। हमने कई विखंडन घटनाओं को देखा जिससे कुछ घंटों के बाद mCFUs आर्किया के माइक्रोग्रेप की तरह दिखने लगे। इन ओटी छवियों से, एमसीएफयू बायोमास को समय के साथ मापा गया और चित्र 7बी में प्रस्तुत किया गया। दिलचस्प बात यह है कि एस. शिबाटे एमसीएफयू ने जी. स्टीयरोथर्मोफिलस एमसीएफयू के साथ देखी गई घातीय वृद्धि के बजाय रैखिक वृद्धि दिखाई। कोशिका वृद्धि दर की प्रकृति के बारे में लंबे समय से चर्चा चल रही है: जबकि कुछ अध्ययन रोगाणुओं की वृद्धि दर की रिपोर्ट करते हैं जो उनके आकार (घातीय वृद्धि) के लिए आनुपातिक हैं, अन्य एक स्थिर दर (रैखिक या द्विरेखीय वृद्धि) दिखाते हैं। जैसा कि त्ज़ूर एट अल.53 द्वारा समझाया गया है, घातीय और (द्वि)रेखीय वृद्धि के बीच अंतर करने के लिए बायोमास माप में <6% की सटीकता की आवश्यकता होती है, जो अधिकांश क्यूपीएम तकनीकों के लिए पहुंच से बाहर है, यहां तक ​​कि इंटरफेरोमेट्री भी शामिल है। जैसा कि त्ज़ूर एट अल.53 द्वारा समझाया गया है, घातीय और (द्वि)रेखीय वृद्धि के बीच अंतर करने के लिए बायोमास माप में <6% की सटीकता की आवश्यकता होती है, जो अधिकांश क्यूपीएम तकनीकों के लिए पहुंच से बाहर है, यहां तक ​​कि इंटरफेरोमेट्री भी शामिल है। Кабъяснили и तुम्हारा и др.53, различени होने то недостижимо для болшинства методов qpm, даже с и исполззованием интеророметрииииииिश्चित। जैसा कि ज़ूर एट अल.53 द्वारा समझाया गया है, घातांकीय और (द्वि)रेखीय वृद्धि के बीच अंतर करने के लिए बायोमास माप में <6% सटीकता की आवश्यकता होती है, जो अधिकांश क्यूपीएम विधियों के लिए अप्राप्य है, यहां तक ​​कि इंटरफेरोमेट्री का उपयोग करके भी।जैसा कि ज़ूर एट अल द्वारा समझाया गया है। 53, घातीय और (द्वि)रेखीय वृद्धि के बीच अंतर करने के लिए बायोमास माप में 6% से कम सटीकता की आवश्यकता होती है, जो अधिकांश क्यूपीएम विधियों के लिए अप्राप्य है, यहां तक ​​​​कि जब इंटरफेरोमेट्री का उपयोग किया जाता है। सीजीएम बायोमास माप36,48 में उप-पीजी सटीकता के साथ इस सटीकता को प्राप्त करता है।
एक टाइम-लैप्स जिसमें 6 ओटी छवियां (तेल विसर्जन, 60x, एनए उद्देश्य 1.25) और (बी) सीजीएम के साथ मापा गया माइक्रो-सीएफयू बायोमास विकास शामिल है। अधिक जानकारी के लिए मूवी M7 देखें।
एस शिबाटे की पूरी तरह से रैखिक वृद्धि अप्रत्याशित थी और अभी तक रिपोर्ट नहीं की गई है। हालाँकि, घातीय वृद्धि की उम्मीद है, कम से कम इसलिए क्योंकि समय के साथ, 2, 4, 8, 16 ... कोशिकाओं के कई विभाजन होने चाहिए। हमने अनुमान लगाया कि रैखिक वृद्धि सघन कोशिका पैकिंग के कारण कोशिका अवरोध के कारण हो सकती है, जैसे कोशिका की वृद्धि धीमी हो जाती है और अंततः कोशिका घनत्व बहुत अधिक होने पर निष्क्रिय अवस्था में पहुँच जाती है।
हम रुचि के निम्नलिखित पांच बिंदुओं पर बारी-बारी से चर्चा करके निष्कर्ष निकालते हैं: हीटिंग की मात्रा में कमी, थर्मल जड़ता में कमी, सोने के नैनोकणों में रुचि, मात्रात्मक चरण माइक्रोस्कोपी में रुचि, और एक संभावित तापमान सीमा जिसमें एलए-एचटीएम का उपयोग किया जा सकता है।
प्रतिरोधी हीटिंग की तुलना में, एचटीएम विकास के लिए उपयोग की जाने वाली लेजर हीटिंग कई फायदे प्रदान करती है, जिसे हम इस अध्ययन में दर्शाते हैं। विशेष रूप से, माइक्रोस्कोप के दृश्य क्षेत्र में तरल मीडिया में, हीटिंग की मात्रा कुछ (10 माइक्रोन) 3 वॉल्यूम के भीतर रखी जाती है। इस तरह, केवल देखे गए रोगाणु सक्रिय होते हैं, जबकि अन्य बैक्टीरिया निष्क्रिय होते हैं और नमूने का आगे अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है - हर बार नए तापमान की जांच करने के लिए नमूने को बदलने की कोई आवश्यकता नहीं है। इसके अलावा, माइक्रोस्केल हीटिंग तापमान की एक बड़ी श्रृंखला की प्रत्यक्ष जांच की अनुमति देता है: चित्र 4 सी 3 घंटे की फिल्म (मूवी एम 3) से प्राप्त किया गया था, जिसके लिए आमतौर पर कई नमूनों की तैयारी और जांच की आवश्यकता होती है - अध्ययन के तहत प्रत्येक नमूने के लिए एक। y प्रयोग में दिनों की संख्या को दर्शाने वाला तापमान है। गर्म आयतन को कम करने से माइक्रोस्कोप के सभी आसपास के ऑप्टिकल घटक, विशेष रूप से ऑब्जेक्टिव लेंस, कमरे के तापमान पर रहते हैं, जो अब तक समुदाय के सामने आने वाली एक बड़ी समस्या रही है। LA-HTM का उपयोग तेल विसर्जन लेंस सहित किसी भी लेंस के साथ किया जा सकता है, और दृश्य क्षेत्र में अत्यधिक तापमान होने पर भी यह कमरे के तापमान पर रहेगा। लेजर हीटिंग विधि की मुख्य सीमा जो हम इस अध्ययन में रिपोर्ट करते हैं वह यह है कि जो कोशिकाएं चिपकती या तैरती नहीं हैं वे दृश्य क्षेत्र से दूर हो सकती हैं और अध्ययन करना मुश्किल हो सकता है। कुछ सौ माइक्रोन से अधिक तापमान वृद्धि प्राप्त करने के लिए कम आवर्धन लेंस का उपयोग करना एक समाधान हो सकता है। यह सावधानी स्थानिक विभेदन में कमी के साथ है, लेकिन यदि लक्ष्य सूक्ष्मजीवों की गति का अध्ययन करना है, तो उच्च स्थानिक विभेदन की आवश्यकता नहीं है।
सिस्टम को गर्म करने (और ठंडा करने) के लिए समय का पैमाना \({{{{\rm{\tau }}}}}}_{{\mbox{D}}}}\) इसके आकार पर निर्भर करता है, कानून के अनुसार \({{({\rm{\tau }}}}}}}_{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\), जहां \ (L\ ) ताप स्रोत का विशिष्ट आकार है (हमारे अध्ययन में लेजर बीम का व्यास \(L\ लगभग 100\) μm है), \(D\) पर्यावरण की तापीय प्रसार क्षमता है (हमारे में औसत) केस, ग्लास और पानी प्रसार दर\(D\ लगभग 2\गुना {10}^{-7}\) m2/s)। तापमान में परिवर्तन की उम्मीद की जा सकती है। तापमान वृद्धि की यह तात्कालिक स्थापना न केवल प्रयोग की अवधि को कम करती है, बल्कि तापमान प्रभावों के किसी भी गतिशील अध्ययन के लिए सटीक समय \(t=0\) की भी अनुमति देती है।
हमारी प्रस्तावित विधि किसी भी प्रकाश-अवशोषित सब्सट्रेट (उदाहरण के लिए, आईटीओ कोटिंग वाले वाणिज्यिक नमूने) पर लागू होती है। हालाँकि, सोने के नैनोकण अवरक्त में उच्च अवशोषण और दृश्य सीमा में कम अवशोषण प्रदान करने में सक्षम हैं, जिनमें से बाद की विशेषताएं दृश्य सीमा में प्रभावी ऑप्टिकल अवलोकन के लिए रुचिकर हैं, खासकर जब प्रतिदीप्ति का उपयोग करते हैं। इसके अलावा, सोना जैव-संगत है, रासायनिक रूप से निष्क्रिय है, ऑप्टिकल घनत्व को 530 एनएम से निकट अवरक्त तक समायोजित किया जा सकता है, और नमूना तैयार करना सरल और किफायती29 है।
ट्रांसवर्स ग्रेटिंग वेवफ्रंट माइक्रोस्कोपी (सीजीएम) न केवल सूक्ष्म पैमाने पर तापमान मानचित्रण की अनुमति देता है, बल्कि बायोमास निगरानी भी करता है, जो इसे एलए-एचटीएम के संयोजन में विशेष रूप से उपयोगी (यदि आवश्यक नहीं है) बनाता है। पिछले दशक में, अन्य तापमान माइक्रोस्कोपी तकनीकें विकसित की गई हैं, विशेष रूप से बायोइमेजिंग के क्षेत्र में, और उनमें से अधिकांश को तापमान-संवेदनशील फ्लोरोसेंट जांच 54,55 के उपयोग की आवश्यकता होती है। हालाँकि, इन तरीकों की आलोचना की गई है और कुछ रिपोर्टों ने कोशिकाओं के भीतर अवास्तविक तापमान परिवर्तन को मापा है, संभवतः इस तथ्य के कारण कि प्रतिदीप्ति तापमान के अलावा कई कारकों पर निर्भर करती है। इसके अलावा, अधिकांश फ्लोरोसेंट जांच उच्च तापमान पर अस्थिर होती हैं। इसलिए, क्यूपीएम और विशेष रूप से सीजीएम ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके उच्च तापमान पर जीवन का अध्ययन करने के लिए एक आदर्श तापमान माइक्रोस्कोपी तकनीक का प्रतिनिधित्व करते हैं।
एस शिबाटे के अध्ययन, जो 80 डिग्री सेल्सियस पर इष्टतम रूप से रहते हैं, से पता चलता है कि एलए-एचटीएम को केवल साधारण थर्मोफाइल ही नहीं, बल्कि हाइपरथर्मोफाइल का अध्ययन करने के लिए भी लागू किया जा सकता है। सिद्धांत रूप में, एलए-एचटीएम का उपयोग करके तापमान की सीमा तक पहुंचने की कोई सीमा नहीं है, और यहां तक ​​कि 100 डिग्री सेल्सियस से ऊपर के तापमान को बिना उबाले वायुमंडलीय दबाव में पहुंचा जा सकता है, जैसा कि वायुमंडलीय में हाइड्रोथर्मल रसायन विज्ञान अनुप्रयोगों में 38 के हमारे समूह द्वारा प्रदर्शित किया गया है। दबाव A. सोने के नैनोकणों 40 को इसी तरह गर्म करने के लिए लेजर का उपयोग किया जाता है। इस प्रकार, एलए-एचटीएम में मानक परिस्थितियों (यानी पर्यावरणीय तनाव के तहत) के तहत मानक उच्च रिज़ॉल्यूशन ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के साथ अभूतपूर्व हाइपरथर्मोफाइल का निरीक्षण करने के लिए उपयोग किए जाने की क्षमता है।
सभी प्रयोग घरेलू माइक्रोस्कोप का उपयोग करके किए गए, जिसमें कोहलर रोशनी (एलईडी, एम625एल3, थोरलैब्स, 700 मेगावाट के साथ), मैनुअल एक्सवाई मूवमेंट के साथ नमूना धारक, उद्देश्य (ओलंपस, 60x, 0.7 एनए, वायु, एलयूसीप्लानएफएलएन60एक्स या 60x, 1.25 एनए, तेल) शामिल थे। , UPLFLN60XOI), तीव्रता और वेवफ्रंट इमेजिंग प्रदान करने के लिए CGM कैमरा (QLSI क्रॉस ग्रेटिंग, 39 µm पिच, एंडोर ज़ायला कैमरा सेंसर से 0.87 मिमी), और रिकॉर्ड करने के लिए sCMOS कैमरा (ORCA फ़्लैश 4.0 V3, 16-बिट मोड, Hamamatsu से) चित्र 5 (जीवाणु तैराकी) में दिखाया गया डेटा। डाइक्रोइक बीम स्प्लिटर 749 एनएम ब्राइटलाइन एज (सेमरॉक, FF749-SDi01) है। कैमरे के सामने वाला फ़िल्टर 694 शॉर्ट पास फ़िल्टर (FF02-694/SP-25, सेमरॉक) है। टाइटेनियम नीलमणि लेजर (लेजर वर्डी जी10, 532 एनएम, 10 डब्ल्यू, पंपित सुनामी लेजर कैविटी, चित्र 2-5 में स्पेक्ट्रा-भौतिकी, आगे मिलेनिया लेजर द्वारा प्रतिस्थापित, स्पेक्ट्राफिजिक्स 10 डब्ल्यू, पंप्ड मीरा लेजर कैविटी, सुसंगत, चित्र 2 के लिए। -5). 6 और 7) तरंग दैर्ध्य \({{({\rm{\lambda }}}}}}=800\) एनएम पर सेट हैं, जो सोने के नैनोकणों के प्लास्मोन अनुनाद स्पेक्ट्रम से मेल खाती है। स्थानिक प्रकाश न्यूनाधिक (1920 × 1152 पिक्सेल) मीडोवलार्क ऑप्टिक्स से खरीदे गए थे। होलोग्राम की गणना गेर्चबर्ग-सैक्सटन एल्गोरिथ्म का उपयोग करके की गई थी जैसा कि लिंक 39 में बताया गया है।
क्रॉस ग्रेटिंग वेवफ्रंट माइक्रोस्कोपी (सीजीएम) एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी तकनीक है जो एक पारंपरिक कैमरे के सेंसर से एक मिलीमीटर की दूरी पर दो-आयामी विवर्तन ग्रेटिंग (जिसे क्रॉस ग्रेटिंग भी कहा जाता है) के संयोजन पर आधारित है। सीजीएम का सबसे आम उदाहरण जिसे हमने इस अध्ययन में उपयोग किया है, उसे चार-तरंग दैर्ध्य अनुप्रस्थ शिफ्ट इंटरफेरोमीटर (क्यूएलएसआई) कहा जाता है, जहां क्रॉस-ग्रेटिंग में एक तीव्रता/चरण चेकरबोर्ड पैटर्न होता है जिसे प्रिमोट एट अल द्वारा पेश और पेटेंट किया जाता है। 200034 में। ऊर्ध्वाधर और क्षैतिज झंझरी रेखाएं सेंसर पर ग्रिड जैसी छाया बनाती हैं, जिसके विरूपण को घटना प्रकाश के ऑप्टिकल वेवफ्रंट विरूपण (या समतुल्य चरण प्रोफ़ाइल) प्राप्त करने के लिए वास्तविक समय में संख्यात्मक रूप से संसाधित किया जा सकता है। जब माइक्रोस्कोप पर उपयोग किया जाता है, तो एक सीजीएम कैमरा नैनोमीटर36 के क्रम पर संवेदनशीलता के साथ, एक छवि वाली वस्तु के ऑप्टिकल पथ अंतर को प्रदर्शित कर सकता है, जिसे ऑप्टिकल गहराई (ओटी) के रूप में भी जाना जाता है। किसी भी सीजीएम माप में, ऑप्टिकल घटकों या बीम में किसी भी दोष को खत्म करने के लिए, एक प्राथमिक संदर्भ ओटी छवि ली जानी चाहिए और बाद की किसी भी छवि से घटाई जानी चाहिए।
जैसा कि संदर्भ में वर्णित है, सीजीएम कैमरे का उपयोग करके तापमान माइक्रोस्कोपी की गई थी। 32. संक्षेप में, किसी तरल को गर्म करने से उसका अपवर्तनांक बदल जाता है, जिससे थर्मल लेंस प्रभाव पैदा होता है जो आपतित किरण को विकृत कर देता है। इस वेवफ्रंट विरूपण को सीजीएम द्वारा मापा जाता है और तरल माध्यम में त्रि-आयामी तापमान वितरण प्राप्त करने के लिए एक डिकोनवोल्यूशन एल्गोरिदम का उपयोग करके संसाधित किया जाता है। यदि सोने के नैनोकणों को पूरे नमूने में समान रूप से वितरित किया जाता है, तो बेहतर चित्र बनाने के लिए बैक्टीरिया-मुक्त क्षेत्रों में तापमान मानचित्रण किया जा सकता है, जो कि हम कभी-कभी करते हैं। संदर्भ सीजीएम छवि को बिना गर्म किए (लेजर बंद करके) प्राप्त किया गया और बाद में लेजर चालू करके छवि में उसी स्थान पर कैप्चर किया गया।
तापमान इमेजिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले उसी सीजीएम कैमरे का उपयोग करके शुष्क द्रव्यमान माप प्राप्त किया जाता है। बैक्टीरिया की उपस्थिति के कारण ओटी में किसी भी असमानता को औसत करने के साधन के रूप में एक्सपोज़र के दौरान नमूने को x और y में तेजी से घुमाकर सीजीएम संदर्भ छवियां प्राप्त की गईं। बैक्टीरिया की ओटी छवियों से, रेफरी में वर्णित प्रक्रिया का पालन करते हुए, मैटलैब के होममेड सेगमेंटेशन एल्गोरिदम (उपधारा "संख्यात्मक कोड" देखें) का उपयोग करके चयनित क्षेत्रों पर छवियों के एक समूह का उपयोग करके उनका बायोमास प्राप्त किया गया था। 48. संक्षेप में, हम संबंध का उपयोग करते हैं \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\), जहां \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) ऑप्टिकल डेप्थ इमेज है, \(m\) है शुष्क भार और \({{{{\rm{\alpha }}}}}}\) एक स्थिरांक है। हमने \({{{\rm{\alpha))))))=0.18\) µm3/pg को चुना, जो जीवित कोशिकाओं के लिए एक विशिष्ट स्थिरांक है।
सोने के नैनोकणों से लेपित 25 मिमी व्यास और 150 µm मोटी एक कवर स्लिप को सोने के नैनोकणों के साथ एक एटोफ्लोरTM कक्ष (थर्मोफिशर) में रखा गया था। जियोबैसिलस स्टीयरोथर्मोफिलस को प्रयोगों के प्रत्येक दिन से पहले रात भर एलबी माध्यम (200 आरपीएम, 60 डिग्री सेल्सियस) में पूर्व-संवर्धित किया गया था। 0.3 से 0.5 के ऑप्टिकल घनत्व (ओडी) के साथ जी. स्टीयरोथर्मोफिलस के निलंबन की 5 μl की एक बूंद को सोने के नैनोकणों के साथ एक कवर स्लिप पर रखा गया था। फिर, केंद्र में 5 मिमी व्यास वाले छेद के साथ 18 मिमी व्यास वाला एक गोल कवर स्लिप ड्रॉप पर गिराया गया था, और समान ऑप्टिकल घनत्व के साथ 5 μl बैक्टीरियल सस्पेंशन को छेद के केंद्र पर बार-बार लगाया गया था। कवरस्लिप्स पर कुएं संदर्भ में वर्णित प्रक्रिया के अनुसार तैयार किए गए थे। 45 (अधिक जानकारी के लिए अनुपूरक सूचना देखें)। फिर तरल परत को सूखने से बचाने के लिए कवरस्लिप में 1 मिलीलीटर एलबी मीडियम मिलाएं। ऊष्मायन के दौरान माध्यम के वाष्पीकरण को रोकने के लिए अंतिम कवरस्लिप को एटोफ्लोर™ कक्ष के बंद ढक्कन के ऊपर रखा जाता है। अंकुरण प्रयोगों के लिए, हमने बीजाणुओं का उपयोग किया, जो पारंपरिक प्रयोगों के बाद, कभी-कभी शीर्ष कवरस्लिप को ढक देते थे। सल्फ़ोलोबस शिबाटे को प्राप्त करने के लिए एक समान विधि का उपयोग किया गया था। थियोबैसिलस सेराटा की प्रारंभिक खेती के तीन दिन (200 आरपीएम, 75 डिग्री सेल्सियस) मध्यम 182 (डीएसएमजेड) में किए गए थे।
सोने के नैनोकणों के नमूने माइक्रेलर ब्लॉक कॉपोलीमर लिथोग्राफी द्वारा तैयार किए गए थे। इस प्रक्रिया का अध्याय में विस्तार से वर्णन किया गया है। 60. संक्षेप में, टोल्यूनि में HAuCl4 के साथ कॉपोलिमर को मिलाकर सोने के आयनों को घेरने वाले मिसेल को संश्लेषित किया गया था। फिर साफ किए गए कवरस्लिप्स को घोल में डुबोया गया और सोने के बीज प्राप्त करने के लिए एक कम करने वाले एजेंट की उपस्थिति में यूवी विकिरण के साथ इलाज किया गया। अंत में, 16 मिनट के लिए केएयूसीएल4 और इथेनॉलमाइन के जलीय घोल के साथ एक कवरस्लिप से संपर्क करके सोने के बीज उगाए गए, जिसके परिणामस्वरूप निकट अवरक्त में गैर-गोलाकार सोने के नैनोकणों की एक अर्ध-आवधिक और बहुत समान व्यवस्था हुई।
इंटरफेरोग्राम को ओटी छवियों में बदलने के लिए, हमने एक होममेड एल्गोरिदम का उपयोग किया, जैसा कि लिंक में बताया गया है। 33 और निम्नलिखित सार्वजनिक भंडार में मैटलैब पैकेज के रूप में उपलब्ध है: https://github.com/baffou/CGMprocess। पैकेज रिकॉर्ड किए गए इंटरफेरोग्राम (संदर्भ छवियों सहित) और कैमरा सरणी दूरी के आधार पर तीव्रता और ओटी छवियों की गणना कर सकता है।
किसी दिए गए तापमान प्रोफ़ाइल को प्राप्त करने के लिए एसएलएम पर लागू चरण पैटर्न की गणना करने के लिए, हमने पहले से विकसित होममेड एल्गोरिदम39,42 का उपयोग किया जो निम्नलिखित सार्वजनिक भंडार में उपलब्ध है: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping। इनपुट वांछित तापमान क्षेत्र है, जिसे डिजिटल रूप से या मोनोक्रोम बीएमपी छवि के माध्यम से सेट किया जा सकता है।
कोशिकाओं को विभाजित करने और उनके सूखे वजन को मापने के लिए, हमने निम्नलिखित सार्वजनिक भंडार में प्रकाशित हमारे मैटलैब एल्गोरिदम का उपयोग किया: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation। प्रत्येक छवि पर, उपयोगकर्ता को रुचि के बैक्टीरिया या एमसीएफयू पर क्लिक करना होगा, छड़ी की संवेदनशीलता को समायोजित करना होगा और चयन की पुष्टि करनी होगी।
अध्ययन डिज़ाइन के बारे में अधिक जानकारी के लिए, इस लेख से जुड़ा नेचर रिसर्च रिपोर्ट सार देखें।
इस अध्ययन के परिणामों का समर्थन करने वाला डेटा उचित अनुरोध पर संबंधित लेखकों से उपलब्ध है।
इस अध्ययन में प्रयुक्त स्रोत कोड विधि अनुभाग में विस्तृत है, और डिबग संस्करण निम्नलिखित रिपॉजिटरी में https://github.com/baffou/ से डाउनलोड किया जा सकता है: SLM_temperatureShaping, CGMprocess, और CGM_magicWandSegmentation।
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